几种测蛋白含量方法的比较.doc

文档介绍：几种测蛋白含量方法的比较
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定
(一) 蛋白质测定方法的比较(原理、优缺点)
蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。蛋白质含量测定法,目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法(Lowry法)和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。定氮法较复杂,但准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。在选择方法时应该考虑:(1)实验测定要求的灵敏度和精确度;(2)蛋白质的性质;(3)溶液中存在的干扰物质;(4)测定花费时间。
1 微量凯氏定氮法(GB -2010)
。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤
,~ ,误差为±2%;操作复杂费时,整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。,测得结果为总氮含量,包括蛋白氮和非蛋白氮含量;适用范围广,几乎所有样品均可用此方法。
2 双缩脲比色法
。因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。
,即可测定。先绘制标准曲线,再测定样品
1~20mg , 20~30分钟操作简便、呈色稳定性好、试剂单一;测定结果与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关;灵敏度不高,约为1mg,双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
3 福林酚法(Lowry法)
+螯合,形成蛋白质一铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下,利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。该化合物在750nm有最大吸收峰。
、乙液后可见光度计750nm测定;先绘制标准曲线、再测定样品。
,但试剂可长期保存;测定灵敏度高,约5mg ,测定时间约40~60分钟,操作简便;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化(测定结果受待测样品蛋白中肽键存在形式及含量的影响)。
4 紫外吸收法
,酪