文档介绍：医学遗传学实验复****提纲
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SDS是离子型去污剂,能够有效插入脂质双层,破坏膜结构,暴露核物质,而且SDS带有极强的负电荷,具有极强的蛋白质变性作用,可以使胞内的核酸酶变性失活,减少对DNA的降解,保持DNA的完整性。
,推测DNA提取试剂盒中各种试剂的作用?
缓冲液GA:可能含有SDS等成分,裂解细胞,为蛋白酶K提供合适的反应体系
蛋白酶K :消化结合DNA的核蛋白质以及胞内核酸酶,暴露DNA,提高DNA完整性。(这里蛋白酶K的最适温度为56℃)
GA+蛋白酶K应该起到了消化液的作用。
缓冲液GB:可能含有蛋白变性剂,进一步变性蛋白,暴露DNA。(应该属于分离纯化的范畴) 缓冲液GD:主要作用是去除残留的蛋白质。
漂洗液PW:洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质。
洗脱缓冲液TB:用于洗脱结合在亲和柱上的DNA,同时防止DNA降解。
%?
内切酶需要放在-20℃保存,为了防止溶液冰冻及蛋白质变性,酶液中含有较高浓度的甘油。反应体系中内切酶用量过大会增大反应体系内的甘油含量,较高的甘油浓度会导致内切酶星号活性的产生,使得内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这是我们不希望发生的。
***凝胶电泳时需要哪些组分?各自的作用是什么?
丙烯酰***聚合单体
甲叉双丙烯酰***(bis) 交联单体
过硫酸铵(APS) 催化剂,提供自由基催化单体聚合反应
四***乙二***(TEMED/TMEDA) 引发剂,引发过硫酸铵分解产生自由基催化聚合反应尿素(变性胶中) 变性剂
Tris碱 pH调节剂
***凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的异同。
同:
①均为凝胶电泳,原理相同。
琼脂糖、聚丙烯酰***均为无反应活性的稳定支持介质,可降低对流运动,故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下,DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。
②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小;浓度越高,空隙越小,其分辨能力也就越强;反之,浓度降低,空隙就增大,其分辨能力也就随之减弱。凝胶浓度的选择依 DNA 分子的大小而定。③电泳缓冲液 TBE TAE TPE
④指示剂溴酚兰和二甲苯青
⑤染色溴化乙锭银染
异:
①凝胶介质及制备
琼脂糖凝胶电泳中支持物琼脂糖是天然高聚物,加热熔化后冷却形成凝胶,制备简便,快速。聚丙烯酰***凝胶是由单体室温聚合而成,使用有毒的化学试剂,制备时间长。可长期保存。②电泳方式
琼脂糖凝胶电泳为水平电泳,电压为 1-5V/cm。
聚丙烯酰***凝胶电泳为垂直电泳,电压为 1-8V/cm。
③分子量范围及分辨率
琼脂糖凝胶分辨DN***-50kb之间。
聚丙烯酰***分辨DN***段的范围为1-1000bp,%,相差1bp的DNA也可分开,适
合分离鉴定低分子量蛋白质和核酸。
? 最主要的问题–污染? 指数扩增模板
? 非常特异
? 痕量污染物即可导致问题发生? 解决方案
? 使用超纯试剂
? 在PCR之前、之后纯化? 设置阴性对照
? 分装液体试剂