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二、材料
96孔细胞培养板、加样器(200ul)、枪头、Eppendorf管()
伪狂犬病病毒液(PRV)
IBRS-2细胞(猪肾传代细胞)
培养液:含5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
PRV感染IBRS-2典型病变:
细胞变圆、固缩,折射率增加
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三、实验用传代细胞的准备
取长满单层的细胞(IBRS-2)一瓶,倾去培养液。
加入1-2ml胰酶消化液,于37℃培养箱放置几分钟,至细胞间出现空隙或细胞变圆后,倒去消化液。
加入生长液,反复吹打几次,使细胞分散成单个细胞,加入5%犊牛血清的DMEM使细胞为4~6×105/ml.
(已经制备好,分装在瓶中)
(如果为传代细胞培养,将消化后的细胞分装于2-3个小瓶中。再在每个小瓶中补充10%犊牛血清的DMEM至10ml,置37℃培养箱培养1-2天即可长成单层。)
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1、半数致死量(50%lethaldose,LD50):
指能使接种的实验动物于感染后一定时间内死亡一半所需的活微生物量或***量。
2、半数鸡胚感染量(egg50%infectivedose,EID50):
指能使半数试验对象(动物、鸡胚或细胞)发生感染的病原微生物的量。
3、组织培养半数感染量(50%tissuecultureinfectivedose,TCID50)
4、蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU)
四、测定病毒感染力的方法
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(PRV)作连续10倍的稀释,从10-1-10-10。
将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种100µl。
在每孔加入细胞悬液100µl,使细胞量达到2~3×105/ml
设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排(100µl生长液+100µl细胞悬液)
逐日观察并记录结果,一般需要观察3-7天。
结果的计算,Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID50的操作步骤
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六、TCID50的计算方法
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CPE:Cytopathiceffect
1、Reed-Muench法
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距离比例=(-50)/(-40)
=
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于
50%病变率的稀释度的对数
=×(-1)+(-3)
=-
TCID50=10-
含义:,每孔100µl,可使50%接种孔的细胞发生病变
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2、Karber法
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