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作指导书
-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-CompanyOne1
标本采集与制作综合实习(植物病害)
指导教师:丁晓帆适用专业:植保
植物病害标本是对其症状的最直观的记载和描述。它在教学中具有直观、不受季节和区域限制的特
点。因此,植物病害标本的采集、制作和保存是植物病理学科实验(习)教学中必不可少的基础知识和
技能。
在植物病害标本的采集和制作过程中,应对症状的变化情况给以特殊的注意。例如,症状可能表现
为典型症状,也可能表现为非典型症状,在采集时,均应加以注意。一种病害,在同一种植物上,可以
同时表现出多种不同类型的症状;在植物生长发育的不同时期,也可以先后表现出多种不同类型的症
状,如橡胶白粉病。
标本采集后,除去需要及时分离和鉴定的标本外,其余的一般都要经过制作之后保存起来,以备需
要时进行分离和鉴定;或者是在教学和研究时,供观察和识别,要求是能尽量保持原来的性状。
一、目的要求
学会采集植物病害标本的基本方法。通过对常见的叶片和果穗等干标本以及对柔嫩果实的浸渍标本
的制作,同时训练真菌玻片标本的制作,学习并掌握标本干燥制作、浸渍制作以及玻片标本制作等基本
方法。
二、基本原理
室外采集标本是获取植物病害标本的重要途径,也是熟悉植物病害的症状,了解植物病害发生情况的
最好方式。标本的制作是为了日后能较为方便地观察植物病害的症状,无论用干燥制作法保存标本,还
是用浸渍制作法保存标本,都是为了尽量减缓所保存标本变质的速度或不使其腐烂霉变。同时也是为了
尽量使标本保持其原色,以延长标本的使用时间和提高标本的保存质量。真菌玻片标本的制作是为了直
观地观察病原物、辅助诊断、鉴定病害种类,并通过永久玻片标本的制作为后续教学工作提供基本素
材。
三、采集和制作标本用具
、采集袋、标本夹、标本纸、标本箱(筒)、剪刀、修枝剪、高枝剪、手
锯、手铲、纸袋、标签、手持放大镜及采集记录本、海拔仪、刀片、载玻片、盖玻片、小木板、挑针、
镊子、滴瓶、各种试剂等。
(1)采集夹。在野外临时收存新采标本的轻便夹子。一般由两个对称的用一些木条按适当的间距平行
排列的栅状板(亦有用胶合板或硬纸板组成的),其上附有背带,在接近四个角落的地方,设有长短可以调
整的活动固定带或弹簧,以适应采集过程中标本逐渐增多的需要。
(2)采集箱。用于临时收存新采集的果实等柔软多汁的标本。是由铁皮制成的扁圆箱,内侧较平,外
侧较鼓,箱门设在外侧,箱上设有背带。
(3)标本夹。是用来翻晒、压制标本的木夹。由两个对称的一些平行排列的栅状板组成。每块栅状板
在接近上下端处钉一根厚实的方木条,木条端部向外突出约5cm长,以便于用绳捆绑标本夹。标本夹
上:应附有约6m长的一条绳子。
(4)标本纸。主要用来吸收标本的水分,使标本逐渐干燥。—般用草纸或麻纸作标本纸,它们的吸水
性较好。旧报纸也可代替,但因其上有油墨吸水性较差。
(5)修枝剪。主要用于剪取较硬或韧性较强的枝条,高处的枝条要使用高枝剪,难于折断的枝干则要
借助于手锯。手铲用来挖掘地下患病植物器官(如根、块根、块茎等)。
、标签、标本瓶、玻璃瓶、玻璃板、塑料绳、标本盒、水浴锅(或
简单的加热装置)、水、硫酸***、亚硫酸、甲醛溶液、明胶、石蜡等。
四、实验操作
(一)室外采集
。如小麦(玉米、美人蕉等)锈病的病叶、水稻稻瘟病的病
叶、玉米叶斑病(大、小斑病)的病叶、大豆(瓜类)霜霉病的病叶、马铃薯晚疫病的病叶、丁香(九
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里香)白粉病的病叶及香蕉黑星病的病叶等,装入采集夹中。尽量剪取整个病叶,同时,对于每一片叶
上的病斑,在颜色、大小以及形状方面都应是较为一致的。
、玉米丝黑穗病的病穗及玉米瘤黑粉病的病穗等,装入采集筒
中。对于黑粉类的病穗,每种病穗要及时放入小的采集袋中,同时注意隔离,以防黑粉散落和不同病穗
间相互混杂。
、番茄(柑橘)溃疡病的病果、辣椒炭疽病的病果以及香蕉黑
星病(炭疽病)的病果等,装入采集筒中。对于此类标本,特别是对于像番茄一类多汁的病果,要特别
加以注意,应先以标本纸分别包裹后,置于采集筒(箱)中,以防相互挤压而变形。
,装入采集筒中。在挖取此类病
害的标本时,要注意挖取点的范围要比较大一些,以保证取得整个根部。同时,对于像根结线虫病害一
类的病根,在除去根须上的泥土时,操作要谨慎,保证其根须上的小根结和卵块不散落。
一般情况下,各种病害的标本最好采集10份以上。对于较薄的较易失水的叶片,如小麦和水稻的叶
片,在采集时应随时携带吸水纸或废旧的书,随采随压,以免叶片迅速打卷而不易展开。
提示:在采集病斑类的叶片标本时,一个叶片上应只有一种类型的病斑。尤其是在各种病害混合发
生时采集标本,更需进行仔细的选择;对于真菌病害,标本应带有子实体,无子实体在回到室内后,鉴
定将非常困难。
(二)采集记录
采集时,要随时作标记。临时标签上一般应记录如下项目:
寄主名称:俗名和学名都有时,应同时记下。
采集时间:一般应记录年、月、日。
采集地点:一般记录到省、市(县)即可,需要时也可记录到镇(乡)等。
采集人:姓名。
海拔高度:按海拔仪指示记录。(可不记)
生态环境:按照山坡地、平坦地、沼泽地;砂质土、肥沃土等记录。
采集序号:一般按照采集时间的先后顺序记录。
提示:寄主名称如有不清楚的,能及时向当地人问明更好;如不能,应记下采集地的位置以及寄主
的一些主要性状,以备鉴定时参考。必要时还应将寄主的花、果实以及其他部位标本一起采得,以便凭
借寄主的标本对该寄主进行分类鉴定。
(三)标本的携带
田间采集后,茎或叶片类的标本装入采集袋中,每一种病叶放入一个小袋内之后,最好再放入一个
大一点的采集袋内;对于根或果实类的标本,各种标本在装入采集筒之前应分别用小采集袋装好密封或
用纸包裹好,然后,再装入采集筒中。对于黑粉类的标本(如玉米丝黑穗的病穗),或腐烂类的标本(如茄
子褐纹病病果)等,要特别注意,标本间不要相互接触沾污,否则,对于病原的鉴定和病害的诊断会有影
响。
(四)标本的整理
在完成田间采集的过程之后,首先要在室内进行标本的取舍和初步的整理。对于同一种病害的标
本,应尽量保留带有典型症状的标本。同时,对于真菌性病害,在发病部位应带有子实体,叶片或果实
要保持完整。在整理时,应使其形状尽量恢复自然状态。对于采集到的比较稀少的标本,如症状不典
型,或暂时观察不到子实体,也不要舍弃。应该同样制作成标本,以备日后采取措施进行鉴定。如果外
出采集,每天晚上都要将当天采集的标本进行整理、压制,第二天及时换纸或晾晒,防止霉变。
(五)干燥标本的制作
,其叶片比较薄,它们的叶片病害标本,需要经
过整理后,立即进行压制。对于此类标本,在压制时,标本间的标本纸最好要多放几层,一般每层至少
用3—5张标本纸,以利于标本中水分的快速散失。
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、大白菜、马铃薯等比较厚、不易失水的叶片,最好经过一段
时间(1~2d)的自然散失水分,然后,再进行压制。自然散失水分的时间不宜过长。在具体操作时,最好
是在叶片将要卷曲但还未卷曲时进行,这与具体植物和环境条件有关。
,每份标本都要附上临时标签,即将临时标签随着标本压在吸水纸之间。临
时标签上的项目不必记载过多,一般只需记录寄主名称和顺序号即可,以防标本间相互混杂。写临时标
签时,应使用铅笔记录,以防受潮后字迹模糊,影响识别。
,要对标本进行形状的整理,尽量使其舒展自然。在整理时,要十分小
心。特别对于比较柔嫩的植物标本,更应多加注意,以免破损。
,前一周的时间里要每天换干燥的吸水纸1次。以后的时间,可隔天换纸,视情
况而定,直至标本完全干燥为止(在正常的晴好的天气条件下,一般经过10d左右的时间即完全干燥)。在
换纸时,注意不要遗失临时标签;要特别注意不要混用已经污染了的纸张;对于完全干燥的标本,要特
别小心移动,以防破碎。
(但应避免强光直射)通风处,置于吸水纸
上,进行自然干燥。同时,也要定期进行翻动,使其整体较为均匀地干燥。对于此类标本的干燥,开始
时,就要选择在比较宽敞的空间内进行,以免其整个形状被挤压而发生变形。
(也可用牛皮纸,对于不用作交流的标本,也可报纸代替),折成纸袋如下
图,纸袋的大小可据标本的大小而定,其折叠方式也可据标本的不同形状而做适当的改进。在装袋时,
要随时贴上正式标签。
(六)浸渍标本的制作
此法制作的标本易保持标本原来的形态和色泽,但保存的时间有限,且需占用比较大的空间。一般
用于制作教学和示范标本。
(1)防腐漂白浸渍液。此种浸渍液是由亚硫酸饱和溶液、酒精和水按照一定比例配制而成。亚硫酸饱
和溶液,即指二氧化硫的饱和水溶液。
(2)保存绿色的浸渍液。常用的有如下几种:①醋酸铜浸渍液。反复用多次后保色能力会逐渐减弱,
需定期补加适量的醋酸铜。②硫酸铜亚硫酸浸渍液.........。用于保存绿色植物组织的效果很好,但应注意密封
容器,必要时每年换1次亚硫酸浸渍液。此种方法也是实验室较为常用的液浸标本的保存方法。③瓦查
(Vacha)浸渍液。由亚硫酸、硫酸铜、酒精、乙酰水杨酸、福尔马林、丁香油和水等成分按比例配制而
成。适于保存叶片和果实的绿色,也可保存梨和苹果等的黄色。
(3)保存黄色和橘红色标本的浸渍液。配制方法是将亚硫酸(含二氧化硫5%~6%)配成4%~10%的
水溶液(%~%)。可保存如杏、梨、柿、黄苹果、柑橘和红辣椒等标本。
(4)保存红色的浸渍液。瓦查(Vacha)保存红色的浸渍液。此种浸渍液分两部分:浸渍液1的主要成分
为***亚钴、福尔马林、***化锡等;浸渍液2的主要成分为福尔马林、亚硫酸、酒精等。将标本洗净
后,在浸渍液1中浸两周,然后在浸渍液2中保存。可用于保存草莓、辣椒、马铃薯以及其他红色的植
物组织,是一种效果比较好的浸渍液。
、玻璃瓶或试管中。浸渍标本最好置于暗处,以减缓
药液的氧化,或防止气温过高时瓶口碎裂。瓶口一般需要密封,临时性封口时,可用蜂蜡、松香和凡士
林配成的混剂封口;永久性封口时,可用酪胶和消石灰配成的混剂封口;也可用明胶、***钾和熟石
膏调制而成的混剂进行永久性的封口。
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(1)配制硫酸铜溶液。根据需要,一般配制1000m15%的硫酸铜水溶液,在适当的玻璃容器中。配制
溶液前,要考虑到所浸标本的大小,保证所浸标本全部位于液面下。
(2)预浸病果。从室外采来新鲜的辣椒炭疽病的病果,在盛有5%的硫酸铜溶液的玻璃瓶中浸24h。浸
病果时,需临时将病果用塑料绳缚在玻璃板上,一起放入溶液中。否则,病果易浮在液面上,特别是对
于像辣椒这样的空心的果实,更易漂浮在液面上。
(3)漂洗病果。从5%的硫酸铜溶液中取出病果,用清水漂洗6h。可固定在水笼头下,打开水阀用流
水进行冲洗。在冲洗时,水流不宜太急,否则,易破损标本,或将子实体冲刷掉。
(4)配制亚硫酸溶液。在标本瓶中将含5%-6%二氧化硫的亚硫酸溶液15ml加水1000ml(也可用如下
方法配制,即将浓硫酸20m1,稀释在1000ml水中然后加亚硫酸钠16g)。
提示:配制溶液时,要记住,将浓硫酸沿瓶壁缓缓倒入水中,切不可将水倒入浓硫酸中,以防发生
事故。
(5)固定病果。将冲洗后的病果用塑料绳将其缚在玻璃板上,一起浸入配制好的亚硫酸溶液中。固定
时,要小心操作,尽量不要损坏标本,保持其完整。
(6)封口。先配制封口剂,具体方法是:取明胶200g,石蜡50g(此两试剂的量可据需要量而定,一般
按照明胶﹕石蜡=4﹕1取量)。将明胶置于玻璃瓶中,用水浸6h,滤去水分。之后,在水浴锅中加热熔
化;再加入石蜡,熔化后即可成为胶状物,趁热进行涂抹封口。
提示:封口剂配制好后,要趁热及时涂抹封口。否则影响封闭效果。
(七)贴标签
无论是装干标本的纸袋,还是装液浸标本的玻璃瓶,都需在其适当位置贴上正式标签(标签模版由.....
指导老师提供......)。对于纸袋,应贴在其右上角的位置;对于玻璃瓶,应贴在瓶体的中央位置。标签的大
小和位置,应根据具体的纸袋的大小和玻璃瓶的大小而定。同时,要兼顾标本袋或标本瓶的整体协调性
和美观性。
(八)真菌永久玻片标本的制作
固定剂:70%酒精、福尔马林、冰醋酸、FAA固定液、纳瓦兴氏固定液、铬酸、醋酸固定液
等。
染色剂:天然染色剂:苏木素、胭脂红、地衣红,在真菌染色中主要用苏木素。
人工染料:番红O,固绿、结晶紫苯***蓝(棉蓝)、酸性品红等
脱水剂:酒精、丁醇、甘油
透明剂:二甲苯、***仿、甲苯、香精油等
粘贴剂:蛋白——甘油粘贴剂、明胶粘贴剂、火棉胶粘贴剂等。
浮载剂:水、乳酚油、希尔液、甘油、乳酸、3%氢氧化钾等
封藏剂:乳酚油、希尔液—甘油、甘油、甘油明胶、聚乙烯醇胶。
封固剂:中性树胶、达玛树胶等。
方法1:
甘油明胶法
载玻片滴希尔放入标微加热除
加甘油明加热溶加小盖玻片树胶封
希尔液(沙氏液:Shear)配方:
醋酸钾(2%)水溶液300毫升甘油120毫升
酒精180毫升
甘油明胶配方:
明胶5克甘油35毫升水30毫升
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制成的甘油明胶,每100毫升可加苯酚1克,有的不加苯酚。明胶在水中浸透,加热
至35℃熔化,加甘油和苯酚搅和,纱布过滤后盛在玻璃瓶中。
方法2:
聚乙烯醇(PVA)法:封藏剂和封固剂
配方一:聚乙烯醇粉末2g***7ml甘油5ml乳酸5ml水20ml
配方二:聚乙烯醇粉末3g,水20ml(水浴补足水)溶化——母液,加等量乳酸及按母液
1/10加甘油,搅匀即成。染液用苯***蓝或酸黄1g溶于100ml乳酸。
载玻片滴希尔放入标微加热除
加聚乙烯加小盖玻加聚乙烯醇树胶封
(九)真菌临时玻片的制作
临时玻片制作方法很多,如涂、撕、粘、挑和切片等,可以根据病原物的类型选择使
用。
1)涂抹法:细菌和酵母菌的培养物常用涂抹法制片。将细菌或酵母菌的悬浮液均匀地
涂在洁净的载玻片上,在酒精灯火焰上烘干、固定,再加盖玻片封固。加盖玻片前还可进行
染色处理,使菌体或鞭毛着色而易于观察。
2)撕取法:用小金属镊子仔细撕下病部表皮或表皮毛制成临时玻片。
3)粘贴法:将塑料胶带纸剪成边长5mm左右的小块(注意胶带上不要印有指印),使
胶面朝下贴在病部,轻按一下后揭下制成玻片。
4)挑取法:用挑针从病组织或基物(如培养基)上挑取表面的霉状物、粉状物或孢子
团制成玻片。
5)组织透明法:将少量病组织材料切成细丝后放在载玻片上,滴加乳酚油后在酒精灯
上徐徐加热至蒸气出现。如此处理数次使组织透明,冷却后加盖玻片进行镜检。此法可以观
察到病原物在寄主内的原有状态。
6)徒手切片:徒手切片时选取病状典型、病征明显的病组织材料,先在病征明显处切
取病组织小块(边长5-8mm),放在小木块上,用食指轻轻压住,随着手指慢慢地后退,
用刀片的刀尖将压住的病组织小块切成很薄的丝或片,用沾有浮载剂的挑针或接种针挑取薄
而合适的材料放在一干净载玻片上的浮载剂液滴中央,盖上盖玻片,仔细擦去多余的浮载剂
(注意浮载剂过多会使观察物出现晃动不稳定现象),即制成一张临时玻片。
浮载剂:
水:溢菌、线虫活动、真菌孢子萌发、大小测量。优点:方便;缺点:产生气泡;易
干燥。
乳酚油:除上述外均可用。优点:杀菌固定、孢子膨胀复原、组织透明;缺点:不易封
固、有毒。
(十)线虫永久玻片的制作
永久玻片标本的制作方法比较复杂,所经过的步骤较多,时间较长。但是保存的时间也
比较长,可使线虫长时间保持原有状态,是线虫标本的重要保存方式。主要包括几个步骤:
杀死-固定-脱水-玻片制作,其中制备方法和试剂选择不同,所制玻片中线虫的虫态和内脏清
晰度不同。
TAF固定液(三乙醇***-福尔马林固定液)
福尔马林(40%甲醛)7ml
三乙醇***(Triethanolamin)2ml
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蒸馏水91ml
FG固定液(福尔马林-冰醋酸)
福尔马林(40%甲醛)8ml
甘油(丙三醇)2ml
蒸馏水90ml[2]
脱水液
甲溶液:福尔马林(40%甲醛)8ml
甘油(丙三醇)2ml
蒸馏水90ml
乙溶液:酒精(95%)95ml
甘油(丙三醇)5ml[3]
乳酸
配制45%的乳酸。
(1-1)常温杀死与固定
先将线虫离心(2000r/min离心3min),用移液器吸出上清液,吸出的上清液要在体视
显微镜下观察,确保没有线虫被吸出,每管装1ml的线虫浓缩液,然后加入等量的FG固定
液或TAF固定液。常温下放置24h。
(1-2)加热杀死与固定
①将装有线虫的指型管放在离心机里,以2000r/min离心3min;
②用移液器吸出上清液,每管装1ml的线虫浓缩液;
③将TAF或FG固定液分装在10ml指型管中,与线虫浓缩液同时放在65℃的恒温水浴锅中
加热150s,加热过程中不断摇晃指型管,使线虫液和固定液受热均匀;
④将等量的固定液分别与线虫悬液混匀,注意动作要轻,常温下放置24h。
(甘油酒精脱水法)
参考武杨和刘斌的方法[6]并做适当修改。
①将固定24h的线虫放在离心机上2000r/min,离心3min;
②在体视显微镜下,用移液器小心将上清液吸出(注意不要将线虫移出);
③将剩余的线虫悬液用移液器移至经过消毒的染色皿中,并将染色皿倾斜放置,保证线虫都
聚集在一起;
④用移液器将甲溶液慢慢加入染色皿中,至染色皿的2/3处,染色皿倾斜放置,使线虫尽量
聚集在甲溶液的底部;
⑤在塑料盒或者干燥器中加入95%酒精,至容器的1/3处。将染色皿盖上盖子并保持原来状
态斜放在塑料盒或者干燥器的隔板上;
⑥将塑料盒盖上盖子并慢慢放进恒温箱中,保持恒温箱的温度在35℃-43℃,过夜。注意:
在线虫放入恒温箱时将乙溶液一并置于恒温箱中,防止操作过程中温差变化过大;
⑦将过夜的染色皿移出并保持原来倾斜状态,在体视显微镜下将甲溶液吸出,再慢慢加入乙
溶液。盖上盖子并留点缝隙,倾斜放入加有纯甘油的密封塑料盒或者干燥器中,41℃下,放
置5h;
⑧将放置5h的染色皿取出,吸出乙溶液,向染色皿中加入几滴纯甘油,盖上染色皿的盖
子,将染色皿置于加有纯甘油的密封塑料盒中,41℃过夜;
⑨将过夜的染色皿的盖子拿掉,并放回加有纯甘油的密封塑料盒中,41℃下放置5h后,线
虫标本即可用于制作永久玻片;
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本方法采用浓度梯度脱水法,将线虫逐级转入浓度更高的甘油中,最后转移至纯甘油
中,保证了在整个制片过程中虫体所处环境的连续性,避免了虫体的变形和观察效果的失
真。本实验过程中染色皿一直处于倾斜状态是为了将线虫聚集在皿低,尽量减少吸出溶液时
将线虫吸出。更换脱水液或者甘油时都要在体视显微镜下观察线虫是否因为脱水过快而变的
干瘪,若发生这种情况可重复前一步的脱水环节,这样可使发生皱缩的线虫标本在一定程度
上得以恢复。
参考JFSouthey的方法[7]并做适当修改。
(1)准备直径、长10cm的T型打孔器,低熔点的石蜡(熔点54℃);
(2)把打孔器端部在酒精灯火焰上加热约10s,尽量使端部受热均匀,趁热迅速将打
孔器端部插到蜡盘中蘸取少许石蜡;
(3)将熔化的蜡尽快粘附在洁净的载玻片中央。如果第一次蘸取的石蜡太少,可以按
上述步骤重复2到3次[5]。待蜡圈凝固后即可使用;
(4)用挑针蘸取一小滴纯甘油放在蜡圈中央;
(5)在体视显微镜用挑针将数条已脱水的线虫挑至载玻片中央的浮载剂中,将载玻片
置于体视显微镜下观察,用挑针小心地将线虫排匀,并使线虫沉于浮载剂底部;
(6)取干净的盖玻片,在体视显微镜下,轻轻盖上盖玻片,使盖玻片置于蜡圈正上
方;
(7)待磁力搅拌器加热至75℃左右时,将玻片放在磁力搅拌加热器上,待蜡圈即将完
全熔化时将玻片移至实验台上冷却,这个过程要尽量避免气泡的产生;
(8)用透明指甲油涂在盖玻片的四周,待指甲油干后再涂一层;
(9)填写线虫标签并贴在对应的玻片上。
五、所需时间流程
-8h晾干保存
-7d杀死固定1d脱水3-7d玻片制备
六、实习任务布置及作业
,按学号顺序,选一个小组长,负责领取、归还实习工具及小组成员安全。
,每种病害标本数量尽量多,如病叶须3-5片(根据实际情况调整)。其中
菌物病害15-18种、原核生物病害5-6种、病毒病害4-6种、线虫病害1-2种、寄生性植物病害2-3种。
、根据标本的特点确定选用干燥制作法(25-28种以上)或浸渍制作法
(2-5种)。
,挑取法和徒手切片法各1片,熟练操作观察到病原为止,指导教师验收。
:封面(课程名称、组员、学号)、标本编号、寄主、病害名称、保存方式、
备注等(附标本图片)。
七、评分标准
根据采集制作的标本数量、标本质量分5个等级:≥90、80-89、70-79、60-69、不及格。
温馨提醒:采集、制作标本时需要借助病害鉴定参考书或工具书,请同学们提前准备:《热区植物常见
病害诊断图谱》(李增平)、《农业植物病理学》(赖传雅南方本)、《热带果树病理学》(谢昌
平)、《热带园艺植物病理学》(张荣意)、《植物病害诊断》(陆家云)、《真菌鉴定手册》(魏景
超)等等。(穿长裤、舒适鞋子,戴帽子,带上防蚊虫药物等)
附录:标签
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海南大学海南大学
病名:水稻纹枯病病名:水稻白叶枯病
病原:Rhizoctoniasolani病原:Xanthomanasoryzae
采集地:海大儋州校区采集地:海大儋州校区
采集人:采集人:
制作人:制作人:
采集期:采集期:
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