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第六章外源基因的表达
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基因工程技术的核心是基因表达技术。
基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA,经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质,再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程,它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。
基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达,即产生人们所需要的高产目的的基因产物,如蛋白质、多肽类生物药物。
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目前已构建出了多种基因表达系统,包括原核生物表达系统和真核生物表达系统,不同的表达系统具有各自的特点。
在原核生物中,基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时,结构基因则开始转录成相应的mRNA,与此同时,mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质,转录完毕时转译也完成,随之mRNA也被水解掉。
在真核生物基因表达系统中,转录是在核内进行的,先生成hnRNA,再加工去掉内含子,外显子相连接,并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质,再经过加工、糖化、形成高级结构。
基因表达在原核生物与真核生物中的差别?
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外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列,是构建一个表达系统首先要考虑的问题。
原核生物启动子
诱导型启动子:
组成型启动子:
如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子
如T7噬菌体的启动子
真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。
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外源基因起始转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。
一方面,要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象;
另一方面,又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物,使mRNA的长度限制在一定的范围内,从而增加外源基因表达的稳定性。
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外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则:
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点,该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9个碱基。
在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。
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不同基因组使用密码子具有选择性。
主密码子(majorcodon)
罕用密码子(rarecodon)
如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近,则该基因表达的效率就高;
反之,若外源基因含有较多的罕用密码子,其表达效率就低。
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避免外源基因表达蛋白降解的对策:
构建融合蛋白表达系统
构建分泌蛋白表达系统
构建包涵体表达系统
选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统
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基因沉默的作用机制
位置效应的基因沉默:
转录水平的基因沉默:
转录后水平的基因沉默:
是指基因在基因组中的位置对其表达的影响
是在DNA水平上的基因调控
是在RNA水平上的基因调控
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