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血液分析仪(综述)(一)
2016-6-9|编辑:admin|查看:263|评论:0|来源:CAIVD
摘要:第一节概述血液分析仪(HematologyAnalyzer),又称血细胞分析仪(BloodCellAnalyzer),也可称为血细胞计数仪(BloodCellCounter),主要用于检测血液标本,能对血液中有形成分进行定性、定量分析,并提供相...
第一节概述
血液分析仪(HematologyAnalyzer),又称血细胞分析仪(BloodCellAnalyzer),也可称为血细胞计数仪(BloodCellCounter),主要用于检测血液标本,能对血液中有形成分进行定性、定量分析,并提供相关信息的仪器。
一、产品定义、性能及应用特点
自50年代初库尔特先生发明了粒子计数技术的专利,制造了第一台血液分析仪并应用于临床以来,血液分析仪的发展已有60年的历史。血液分析仪实质上是指对一定体积内血细胞数量及异质性进行分析的仪器。最初的血球计数仪(CellCounter)仅能计数红细胞(RED)和白细胞(WBC),后来又有了血红蛋白HBG),血小板(PLT),红细胞压积(HCT),平均红细胞体积(MCV)等几个参数。而发展成为血液分析仪(HematologyAnalyzer)后,又增加了许多分析和计算参数,如红细胞体积分布宽度(RDW),平均血小板体积(MPV),血小板体积分布宽度(PDW),血小板压积(PCT),大血小板比率,白细胞三分群,白细胞五分类,血红蛋白浓度分布宽度,异常淋巴细胞提示,幼稚细胞提示等各种参数和功能也不断地添加到一些品牌的仪器上。
为了纪念库尔特先生对血液分析仪的贡献,特将其计数原理命名为库尔特原理(thecoulterprinciple)即电阻抗原理,该原理现已成为血细胞计数和分析中最经典的原理。库尔特原理的基本含义是:在待测液
等参数。
由于血小板和红细胞体积的明显差异,很容易用一个限定阈值将两者同时测得的光电信号区分。因此,迄今为止全血分析中血小板,红细胞检查均采用一个共用的分析系统。但由于血小板和红细胞测量信号常有交叉,如大血小板的脉冲信号可能被误认为红细胞而计数,小红细胞的脉冲信号可能进入血小板通道,造成实验误差。各血液分析仪生产厂家采用多种先进技术以减少血小板计数的干扰,以下我们就分别给予介绍:
扫流技术(sweepflow):由于血小板和红细胞在同一个计数池中计数,红细胞体积较大,在通过正中计数感应区时会形成一个大脉冲,若有回流会同时又产生一个因涡流再度进入感应区边缘而形成的小脉冲使电极可能感应到相当于血小板大小的小脉冲,使血小板计数假性增多。扫流技术是在进行红细胞和血小板计数的同时,在红细胞计数小孔的后面有一个稳定的液流通过,这样可以使后的红细胞被立即冲走,以防止回到感应区被计数为血小板。
传统血液学常规检查方法是借助于显微镜进行人工血液红细胞、白细胞计数和血涂片染色后显微镜进行肉眼人工白细胞分类,每检测一份标本至少要20分钟才能出检测报告,不仅检测项目少,且费时费力,准确性、可靠性受到一定影响,难以进行质量控制。到20世纪50年代血细胞分析仪(AutomatedHeamatologyAnalyzer)问世以来,血细胞自动分析从单一的电阻抗技术发展成为多种技术的融合包括物理学、化学、免疫学、流式细胞术、信息处理技术、如体积传导光散射(VCS)、多角度偏振光散射(MAPSS)等,使对各种血细胞分析结果更加准确可靠;自动化方面,血细胞自动分析已由单一半自动不分类到的三分群/五分类(3/5-partdifferential)发展为血细胞自动分析的流水线,即将全血细胞计数(CBC)、网织红细胞(Ret)计数、外周血推片和染色等过程实现全自动化,临床应用方面,血细胞自动分析的检测参数由单一的血细胞计数结果发展为可向临床诊断,鉴别诊断、治疗和预后监测提供数二十多个参数。
近年来,我国在血液自动分析领域也取得了十分可喜的成绩。目前,各级医院、乡镇、社区医疗机构血液分析仪已逐步得到普及,CBC检测结果的精密度和准确度明显提高;大中型医院检验科拥有多台血液分析仪,有的大型或教学医院还拥有血液自动分析的流水线;同时,各级医院已基本建立血液自动分析的质控程序,大大提高了全血细胞计数(CBC)的工作效率。
第二节血液分析仪的发展历程
近年来,随着先进仪器的普及应用和技术人员素质的提高,我国的检验医学事业有了飞速的发展。近10年来,各种类型的血液分析仪在国内迅速普及。血液分析仪的应用,不但提高了检验结果的质量和工作效率,而且为临床提供了更多更可靠的试验指标,对疾病的诊断和鉴别诊断起了重要的作用。同时也取得了较好的经济效益和社会效益。
一、血液分析仪的发展
传统的血液学检查:显微镜手工检验法。血细胞计数、白细胞分类结果准确性、可靠性受到一定影响,检验人员费时费力。1947年美国科学家库尔特()发明了用电阻法计数粒子的专利技术。1956年他又将这一技术应用于血细胞计数获得成功,其原理是根据血细胞非传导的性质,以电解质溶液中悬浮血细胞在通过计数小孔时引起的电阻变化进行检测为基础,进行血细胞计数和体积测定,这种方法称为电阻法或库尔特原理。
60年代末血细胞分析仪除可进行血细胞计数外,还可以同时测定HBG血红蛋白。70年代计算机技术快速发展,将血小板计数的繁琐手续(手工分离富血小板血浆后在进行血小板计数),改进成血小板与红细胞同时计数。80年代,发展迅速,在8项检测基础上加上红细胞指数、三个直方图的报告,不仅提供是否贫血,且可对贫血的类型和原因进行分析;血小板参数对止血和血栓疾病的诊断及一些疾病的疗效观察有重要价值。开发了白细胞3分群血细胞分析仪。90年代,开发出五分类血液分析仪和可对网状红细胞进行计数的血细胞分析仪,同时,将激光、射频、化学染色计数应用于对细胞检测更成熟,发展成为血液分析流水线。

最早进行白细胞分类的设备仅根据白细胞的体积分布情况将淋巴细胞单独划分出来。在1970年起Coulter公司开始设计对白细胞进行分类的仪器,并首先推出了二分类的S-PLUS系列仪器,然后在1980年又推出了T系列,都是可进行白细胞二分群的仪器,大家比较熟悉的SysmexF800和F820型也是根据白细胞体积分布直方图进行粗略两分类的仪器。目前半自动或全自动型具有18参数含白细胞三分类的血细胞分析仪已经成为我国医院检验科的主流血细胞分析仪。仅仅根据简单的体积分析法就将血细胞进行分类,无论是三分类(3-partdifferential)还是二分类(2-partdifferential),其实是将细胞按照体积大小进行了简单的分群处理,实际上是不科学的,因此国内专家建议将此分类统一称呼为分群(group),即二分群型或三分群型血细胞分析仪。
第三节现代血液分析仪的主要进展
随着高科技的应用和基础医学的发展,各种先进的血细胞分析测试技术被应用到血液分析仪上。1987年Coulter公司发明的VCS(Volume,V,体积;conductivity,C,电导性;Scatter,S,光散射)技术可使血细胞未经任何处理,在与体内形态完全相同的自然状态下得出检测结果。而在SYSMEX的NE-8000和SF-3000血细胞分析仪中采用了阻抗和射频技术联合的白细胞分类法。进入90年代后,仪器的自动化程度增高(达到120份/小时);可进行多参数分析(高达30余项);精密度高(重复计数;保证微孔管清洁;取中段血;运动流式细胞计数原理;鞘流原理……);向5分类及鉴别幼稚细胞发展;准确度好,全面质量管理,保证仪器检测可靠性;具有智能化,可对同一病人诊断的前后进行对比,提出综合意见,确定诊断方向;更加注意保护操作人员的安全(SLS-Hb、自动混匀、进样、吸样针内外清洗等);向流水线发展,将血液分析仪、网织红细胞计数仪、推片、染色机联成流水操作线。
第四节血液分析仪白细胞五分类法原理和散点图特征
一、简要发展史
1974年,一种名为HEMALOGD的具有初步白细胞分类功能的白细胞分析仪问世。1982年,Technicon公司生产了
H6000型血液细胞分析仪器,应该是首款具有白细胞五分类能力的仪器。同时代日本日立公司推出图像分析法的白细胞分析仪HITACHI8200型,仅仅是用于完成白细胞血片分类的仪器,没有其他血细胞计数分析能力。Technicon公司1985年开发了比较成熟的具有白细胞五分类功能的TechniconH1型血液细胞分析仪,随后升级为H2型和H3型。COULTER公司在1987年开发研制其经典VCS技术,并推出持续具有多年影响力的、具有白细胞五分类功能的血液细胞分析仪MAXM型。
1990年前后,欧洲和日本许多厂家都陆续推出了各种类型的具有白细胞五分类功能的血液分析仪。各厂家设计生产的此类血细胞分析仪,其在白细胞分类技术上原理各不相同,分析测定项目略有不同,且形式多样,结构复杂,试剂种类和成分也趋于复杂。不断改进和升级的新产品使得仪器在白细胞分类技术上更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品(试剂)价格的增加。
二、仪器原理和散点图特点
1、体积、电导和激光散射原理
这是Beckman-Coulter公司生产的血液分析仪所采用的经典分析方法,他集三种物理学检测技术于一体,在细胞处于自然原始的状态下对其进行多参数分析。该方法也称为体积、电导、激光散射血细胞分析法。此技术采用在标本中首先加入红细胞溶血剂溶解掉红细胞,然后加入稳定剂来中和红细胞溶解剂的作用,使白细胞表面、胞浆和细胞体积保持稳定不变。然后应用鞘流技术将细胞推进到流动细胞计数池(Flowcell)中,接受仪器VCS三种技术的检测。V代表体积(Volume)测量法,是采用经典的库尔特专利技术,用低频电流准确分析细胞体积。体积是区分白细胞亚群的一个重要的参数,它可有效区分体积大小差异显著的淋巴细胞和单核细胞。C代表高频电导性(Conductivity),采用高频电磁探针原理测量细胞内部结构间的差异,也是该公司的专利技术。
细胞膜对高频电流具有传导性,当电流通过细胞时,细胞核的化学组份可使电流的传导性产生变化,其变化量可以反映出细胞内含物的信息。该参数可用来区分体积相近而内部性质不同的细胞群体,如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞,由于它们的细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。S代表激光散射(Scatter)测量技术,采用氦氖激光源发出的单色激光扫描每个细胞,收集细胞在10°~70°角度内出现的散射光(MALS)信号。该激光束可穿透细胞,探测细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况,提供有关细胞颗粒性的信息,可以区分出颗粒特性不同的细胞群体。例如细胞内颗粒粗的要比颗粒细的散射光更强,因此可以用于区分粒细胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细胞。
仪器将分析每个细胞在V、C、S三种检测技术上的测量结果,因为不同类别的细胞会在体积、表面特征、内部结构等方面呈现明显的不同。将这些特征性信息被定义到以VCS为三维坐标(分辨率为
256×256×256=16,777,216)所形成的立体散点图中,这五类细胞可在三维空间中形成特定的细胞群。通过计算某群细胞数量占白细胞总数的百分比,即可得到五项白细胞分类结果。仪器不仅仅做出对正常白细胞的五项分类结果,给出典型的散点图型,还可以提示许多异常细胞区域的报警。
VCS技术可通过DF1、DF2、DF3三个散点图将五种类型白细胞明显区分开。三个散点图的纵坐标均定义为细胞体积。DF1为细胞体积和激光散射的直方图,DF2和DF3为细胞体积和高频电导性的直方图,DF3为除去粒细胞群体后显示出淋巴细胞后面的嗜碱性粒细胞图像。VCS技术是Beckman-Coulter公司开发研制的经典专有方法,到目前为止的各种高档血细胞分析仪均采用该方法对白细胞进行分析。该方法在白细胞分析上尚有特殊能力,例如可以测定和分析中性粒细胞的体积、核浆比例、细胞颗粒特性等参数,也就是将中性粒细胞的VCS三个参数分别给出,用于了解细菌感性疾病与其它疾病的区别。也可对淋巴细胞、单核细胞等均作出其细胞群体的三个技术参数值,是比较有前景的研究内容。
仪器在RBC、PLT、WBC计数上依然采用电阻抗法,血红蛋白仍然采用比色法测定。该公司的五分类法血细胞分析仪先后推出多种类型,如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755和最新的LH780等型号,在某些机型还具有网织红细胞分析功能和T淋巴细胞亚群分析功能。
2、电阻抗、射频和细胞化学技术
日本Sysmex公司系列血液分析仪是在国内应用非常广泛的仪器,从三分类法到五分类法的各种型号仪器都有大量用户。其仪器型号种类丰富,功能和测定参数各异,其各种仪器间均有近似的检测原理,但在结合特定的功能以达到不同的分析目的方面,其原理和所用试剂又有不完全相同之处。以XE-2100型血细胞分析仪为例说明其在白细胞计数和分类方面的原理和特点。
SysmexXE-2100在白细胞分类上采用半导体激光流式细胞技术结合核酸荧光染色技术进行白细胞计数和分类。半导体激光照射在通过鞘流技术处理的细
胞上,可根据每个细胞所产生的三种信号来鉴别细胞类别。前向散射光(FSC)信号可反应细胞体积大小;侧向散射光(SSC)信号可反应细胞的颗粒和细胞核
等内含物的信息;侧向荧光(SFL)强度信号则用于分析细胞内脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的含量。
在白细胞分析上主要采用两个通道进行细胞计数和分类,两个通道均采用激光和鞘流进样的方式测定。DIFF通道:STROMATOLYSER-4DL试剂中的表面活性剂可以溶解掉标本中的红细胞和血小板,并在白细胞膜上打出小孔;然后第二种试剂STROMATOLYSER-4DS中的聚次***染料通过这个小孔进入白细胞中,与细胞核的核酸和细胞器结合,在经过波长
633nm的激光照射,产生的荧光强度与细胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER-4DL试剂还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力,可根据侧向散射光信号强度,将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出来。这样可以将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞清楚的分离开。在DIFF散射图当中可以得到白细胞的四个分群(LMNE)。
WBC/BASO通道是专用作检测嗜碱性粒细胞的通道,因为嗜碱性粒细胞数量非常少,因此必须采用特殊技术处理。STROMATOLYSER–FB是一种酸性试剂,可将红细胞和血小板形成淡影化,将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸核形态,然后采用前向散射光(FSC)信号和侧向散射光(SSC)信号使嗜碱性粒细胞从其它细胞中分离出来。前向散射光与细胞体积测定相关,侧向散射光与裸核后的细胞结构复杂性有关。在这个通道中可以获得白细胞总数和嗜碱性粒细胞的数量。
仪器在幼稚粒细胞分析上有特殊的IMI通道,在IMI检测通道中主要应用射频(RF)技术和直流电阻抗法(DC)。这个测定通道根据幼稚细胞膜表面比成熟细胞膜表面含有脂质少的现象,在稀释液中加入硫化氨基酸(IM试剂),由于占位不同,结合在幼稚细胞表面的氨基酸较多,对溶血剂有抵抗作用,对幼稚细胞具有保护作用。当加入溶血剂后成熟细胞易被溶解掉,而幼稚细胞不易被溶解破坏,可通过电阻法检测出来。射频技术用于测量细胞核的大小和颗粒的多少,而直流电信号可反应出细胞体积的大小。
在有核红细胞计数上通过专门的有核红细胞检测程序和专用通道-NRBC通道,在处理标本时加入STROMATOLYSER-NR专用试剂,它能使成熟红细胞溶解
又可保持有核红细胞的核结构,同时也将白细胞保持完好。STROMATOLYSER-NR试剂中的聚次***荧光染料可渗透进入白细胞膜内,将白细胞和有核红细胞的核染色。通过检测荧光强度得到:白细胞核大荧光强度高,有核红细胞核小,荧光强度低,正常红细胞无细胞核和破碎,荧光强度极低。根据荧光强度差和前向散射光信号测定的细胞体积差,可将有核红细胞从其他细胞群中区分出来。该仪器在红细胞和血小板的计数和分析上仍然沿用了经典的电阻抗方法,在血红蛋白测定上采用了无剧毒物质的SLS溶血剂比色法。
3、激光散射和细胞化学染色技术
最早采用该技术的是Technicon公司的H1,H3型,现在的最新型为西门子公司的Advia120型和2120型(2007年以前为Bayer公司产品)。它是一款开发比较早的高等级仪器,其在白细胞分类上采用了过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。在红细胞和血小板分析都采用了双角度激光法。在仪器的管路、电磁阀门、反应杯上采用了独特设计的集成液流版管路系统,是目前血细胞分析仪中所独有和特有的技术。集成液流板实际上是将各种管路和电磁阀门、反应杯等血球计数仪的常用硬件进行综合处理,系统化,微小化,透明化和集成化。形成的集成板被放置在仪器的明显部位,方便观察,并具一定的美观效果。其另一特点则是细小的管路和反应杯可是标本和试剂用量明显减少。
在白细胞分类上,该仪器采用两个通道进行,一个为过氧化酶检测通道,另一个为嗜碱细胞检测通道。过氧化酶反应(peroxidase,POX)是血涂片染色的一个常用细胞化学染色方法,用于鉴别原始细胞与成熟的粒细胞,鉴别粒细胞与非粒细胞。染色后的细胞内无蓝黑色颗粒出现为阴性反应,出现细小颗粒或稀疏样分布的黑色颗粒为弱阳性反应,出现黑色粗大而密集的颗粒为强阳性反应。过氧化物酶主要存在于粒细胞系和单核细胞系中,各类白细胞对过氧化物酶的反应是这样的:早期的原始粒细胞为阴性,早幼粒以后的各阶段都含有过氧化物酶,并随着细胞的成熟过氧化酶含量逐渐增强,中性分叶核粒细胞会出现强阳性反应,嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶反应,嗜碱粒细胞不含此酶呈阴性反应。在单核细胞系统,除早期原始阶段外,幼稚单核和单核细胞会出现较弱的过氧化物酶反应。淋巴细胞、幼稚红细胞、巨核细胞等都为过氧化物酶阴性反应。Advia120/2120血细胞分析仪的过氧化酶(Perox)检测通道就是根据这个原理设计的,它检测每一个通过流动计数池中的白细胞,经过激光照射所产生的过氧化酶散射光吸收率,来当然试剂和辅助试剂均进行了改良。
在Perox通道所产生的散点图,横轴表示在5°-15°激光散射获得的细胞过氧化物酶含量情况,纵轴是低角度散射光测量的细胞体积大小。在此通道内细胞被分为五类。1)过氧化酶最强阳性的嗜酸性粒细胞;2)过氧化酶强阳性的嗜中性分叶核粒细胞;3)体积较大、过氧化酶弱阳性的单核细胞;4)体积较小、过氧化物酶阴性的淋巴细胞;5)体积大于淋巴细胞且过氧化物酶阴性的未染色大细胞,此类细胞增加提示幼稚或原始的各类细胞可能出现。在嗜碱细胞(BASO)通道中采用的检测原理是:专用的嗜碱性粒细胞试剂(BASO)将除了嗜碱性粒细胞以外的白细胞除去细胞膜,使其裸核化并体积变小,仅将嗜碱性粒细胞保持原有状态,体积明显大于其他类的白细胞。在散点图上处于上面区域的为嗜碱性粒细胞;散点图的横坐标可表示细胞核结构的复杂性,处于左侧的为单个核的细胞群,包括单核细胞和淋巴细胞;处于右侧的为分叶核细胞;中间部位则考虑为杆状核细胞;左下端为单个核的原始细胞区。
该仪器在红细胞、血小板的测定上也采用了光学检测技术。通过激光照射扫描每个通过Flowcell的红细胞,低角度散射光(2°~3°)用于测量细胞体积;高角度(5°~15°)散射光测量每个红细胞内的血红蛋白浓度(CH)和血红蛋白含量平均值CHCM。这两个值不受红细胞数量和血红蛋白测定的影响。还可根据每个红细胞内血红蛋白浓度,计算出红细胞内血红蛋白分布宽度(HDW)值。其根据红细胞在体积大小和单个红细胞内血红蛋白含量的分析,将红细胞划分为9个区域,得到红细胞体积和色素含量分布的九分图,也是该仪器在红细胞分析方面独有的特色,根据红细胞分布情况可初步判断疾病类别。在血小板计数分析上也同样采用了二维光散射分析法,即可获得血小板体积大小,可测量1~60fl内的各种大小不同的血小板,还可对血小板内容物含量(MPC)进行测定。血红蛋白测定采用连续流动比色法和红细胞散射光直接测定法两种方法,有助于高脂血和高胆红素血标本的血红蛋白测定准确性。