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活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法,其目的是显示生活细胞内的某些结构,而不影响细胞的生命活动和产生任何物理,,病理状态.
,它是由活的动,植物分离出部分细胞或组织小块,以染料溶液浸染,,堆积在细胞内某些特殊的部分,主要是靠染料的"电化学",酸性染料的胶粒表面带有阴离子,而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子,这样,,理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料,,最为适用的是碱性染料,这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂,胆固醇等)的特性,(JanusgreenB)和中性红(neutralred)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料,对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性.
实验目的
1,观察动,植物活细胞内线粒体,液泡系的形态,数量与分布;
2,学****一些细胞器的超活染色技术.
实验原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器,,(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态.
中性红为弱碱性染料,对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性,只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核与细胞质完全不着色,这可能是与液泡中某些蛋白质有关.
实验用品
1,器材
显微镜,恒温水浴锅,解剖盘,剪刀,镊子,双面刀片,,凹面载玻片,盖玻片,表面皿,吸管,牙签,吸水纸.
2,试剂
(1)Ringer溶液:
***()
***
***
***
蒸馏水100ml
(2)10%,1/3000中性红溶液:
,稍加热(30~40?)使之很快溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶于暗处保存,否则易氧化沉淀,,取已配制的1%中性红溶液1ml,加入29mlRinger溶液混匀,装入棕色瓶备用.
(3)1%,1/5000詹纳斯绿B溶液
称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中,稍加微热(30~40?),使之溶解,用滤纸过滤后,即为1%%原液lml加入49mlRinger溶液,即成1/,以保持它的充分氧化能力.
实验材料
人口腔上皮细胞,小麦种子或黄豆幼根根尖.
实验方法
1,人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察?清洁载玻片放在37?恒温水浴锅的金属板上?滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液?用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞?刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中?染色10~l5min(注意不可使染液干燥,必要时可再加滴染液)?盖上盖玻片,显微镜下观察
2,植物细胞液泡系的超活染色与观察
取豆芽的根尖?用刀片纵切根尖?放入中性红染液滴中,染色5~10min.?吸去染液,滴一滴Ringer液?盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片,使根尖压扁,利于观察)
实验结果
在高倍镜下,先观察根尖部分的生长点的细胞,可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡,,由生长点向延长区观察,在一些已分化长大的细胞内,液泡的染色较浅,体积增大,,一般只有一个淡红色的巨大液泡,占据细胞的绝大部分,将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处.
实验报告
(1).绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布
(2).绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布
线粒体的最新知识
线粒体为线状、长杆状、卵圆形或圆形小体,外被双层界膜。外界膜平滑,内界膜则折成长短不等的嵴并附有基粒。内外界膜之间为线粒体的外室,与嵴内隙相连,内界膜内侧为内室(基质室)(图1-8)。在合成甾类激素的内分泌细胞(如肾上腺皮质细胞、卵甾滤泡细胞、睾丸的Leydig细胞等),线粒体嵴呈小管状。内外界膜的通透性不同,外界膜的通透性高,可容许多种物质通过,而内界膜则构成明显的通透屏障,使一些物质如蔗糖和NADH全然不能通过,而其他物质如Na+和Ca2+等也只有借助于主动运输才能通过。线粒体的基质含有电子致密的无结构颗粒(基质颗粒),与二价阳离子如Ca2+及Mg2+具有高度亲和力。基质中进行着β氧化、氧化脱羧、枸橼酸循环以及尿素循环等过程。在线粒体的外界膜内含有单***氧化酶以及糖和脂质代谢的各种转移酶;在内界膜上则为呼吸链和氧化磷酸化的酶类。
线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。在细胞损伤时最常见的病理改变可概括为线粒体数量、大小和结构的改变:
。衰亡的线粒体可通过保留的线粒体直接分裂为二予以补充。在病理状态下,线粒体的增生实际上是对慢性非特异性细胞损伤的适应性反应或细胞功能升高的表现。例如心瓣膜病时的心肌线粒体、周围血液循环障碍伴间歇性跛行时的骨骼肌线粒体的呈增生现象。
线粒体数量减少则见于急性细胞损伤时线粒体崩解或自溶的情况下,持续约15分钟。慢性损伤时由于线粒体逐渐增生,故一般不见线粒体减少(甚至反而增多)。此外,线粒体的减少也是细胞未成熟和(或)去分化的表现。
。根据线粒体的受累部位可分为基质型肿胀和嵴型肿胀二种类型,而以前者为常见。基质型肿胀时线粒体变大变圆,基质变浅、嵴变短变少甚至消失(图1,9)。在极度肿胀时,线粒体可转化为小空泡状结构(图1,10,图1,11)。此型肿胀为细胞水肿的部分改变。光学显微镜下所谓的浊肿细胞中所见的细颗粒即肿大的线粒体。嵴型肿较少见,此时的肿胀局限于嵴内隙,使扁平的嵴变成烧瓶状乃至
空泡状,而基质则更显得致密。嵴型肿胀一般为可复性,但当膜的损伤加重时,可经过混合型而过渡为基质型。
线粒体为对损伤极为敏感的细胞器,其肿胀可由多种损伤因子引起,其中最常见的为缺氧;此外,微生物***、各种毒物、射线以及渗透压改变等亦可引起。但轻度肿大有时可能为其功能升高的表现,较明显的肿胀则恒为细胞受损的表现。但只要损伤不过重、损伤因子的作用不过长,肿胀仍可恢复。
线粒体的增大有时是器官功能负荷增加引起的适应性肥大,此时线粒体的数量也常增多,例如见于器官肥大时。反之,器官萎缩时,线粒体则缩小、变少。
图1,8心肌细胞线粒体×16000
图1-9线粒体肿
图1,10肾小管上皮细胞线粒体部分空泡变×20000
图1,11线粒体肿胀(基质型)空泡变(心肌缺氧)×8400
,但嵴的增多未必均伴有呼吸链酶的增加。嵴的膜和酶平行增多反映细胞的功能负荷加重,为一种适应状态的表现;反之,如嵴的膜和酶的增多不相平行,则是胞浆适应功能障碍的表现,此时细胞功能并不升高。
在急性细胞损伤时(大多为中毒或缺氧),线粒体的嵴被破坏;慢性亚致死性细胞损伤或营养缺乏时,线粒体的蛋白合成受障,以致线粒体几乎不再能形成新的嵴。
根据细胞损伤的种类和性质,可在线粒体基质或嵴内形成病理性包含物。这些包含物有的呈晶形或副晶形(可能由蛋白构成),如在线粒体性肌病或进行性肌营养不良时所见(图1,12);有的呈无定形的电子致
图1,12线粒体内晶形包含体(进行性肌营养不良症)×120000
密物,常见于细胞趋于坏死时,乃线粒体成分崩解的产物(脂质和蛋白质),被视为线粒体不可复性损伤的表现。线粒体损伤的另一种常见改变为髓鞘样层状结构的形成,这是线粒体膜损伤的结果。
衰亡或受损的线粒体,最终由细胞的自噬过程加以处理并最后被溶酶体酶所降解消化