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兔出血性疾病疫苗及抗原的制作方法.docx

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专利名称:兔出血性疾病疫苗及抗原的制作方法
技术领域:
本发明涉及到在植物中进行的对来自兔出血性疾病病毒的结构抗原VP60或其片段的生产以及这些抗原作为一种抗兔出血性疾病病毒的重组亚基疫苗的应用,这些抗原的生产使用一种基于李痘病毒的病毒载体。
背景技术:
兔出血性疾病(RHD)是成年动物的一种急性致死的感染。被感染的兔通常在感染后48到72小时内死于坏死性肝炎。该疾病的致病物兔出血性疾病病毒(RHDV)为嵌杯状病毒科的一个成员(Ohlingeretal.,,3331-3336;Parra&Prieto,,4013-4015)。
由于目前没有允许所述的病毒进行复制的容许稳定细胞系,等抗RHD的现有疫苗产生自经实验感染RHDV的SPF兔的脾脏或肝脏等。近年来,VP60,RHDV的主要结构蛋白,已经在多种异源系统中进行了生产(Bárcenaetal.,,1114-1123;Bertagnolietal.,,5061-5066;Bogaetal.,,2409-2413;Bogaetal.,,2315-2318;Fischeretal.,,90-96;Laurentetal.,,6794-6798;Marínetal.
,,119-128;Nageshaetal.,1995,ArchVirol140,1095-1108;Plana-Duránetal.,,1423-36;Sibiliaetal.,,5812-5815),包括在转基因植物中进行的生产(etal.,,4452-4455)。在所有的情况下,所获得的重组的VP60蛋白质经显示能够保护兔免受RHDV的致死性侵袭。
目前,植物实验着眼于开发用于产生目的生物疫苗的新系统。植物提供了多个相对于其它表达系统的优势。特别地,它们提供了一种安全、简便并且经济的手段用于在无需昂贵的扩大设备的情况下获得目的蛋白,并且它们可以替代被消耗的传统作物。特别具有利益的是通过植物进行的具有药学价值的蛋白和可被用作为亚基疫苗的蛋白质的生产。
在植物中生产目的分子主要有两种策略(i)对植物核基因组的遗传转化以产生转基因植物,以及(ii)对植物病毒基因组的操作(Arntzen,,221-222)。后一策略提供的优势允许植物在其发育周期的特定点产生相对较大量的所需产物,并且病毒原种可在不经植物传代的情况下长时间保持。
一些系统已被开发用于通过DNA基因组病毒和RNA基因组病毒表达异源蛋白(Scholthofetal.,,299-323)。在本发明的开发中,我们使用了一种
PPV-NK表达载体。这种载体构建自一种李痘病毒PPV(Fernández-Fernández,DoctoralDissertation“Plumpoxvirusasanexpressionvectorinplants.”(April1999))(Fernández-Fernándezetal.,1999)的对象,该申请描述了一种重组DNA的构建,该DNA包含有PPV病毒基因组的cDNA,一个插入于NIb和CP蛋白的编码序列之间的外源序列,以及两种限制性酶(NaeI和KpnI)的识别靶点,并且该载体可用于一种异源蛋白表达载体在植物体内的构建。
该PPV病毒为感染植物的马铃薯y病毒组的一个成员。螺旋状的PPV毒粒由一个被2,000以上个拷贝的单壳体蛋白(CP)包围的信使RNA分子组成(Riechmannetal.,,1-16)。该RNA分子在其5’-末端共价连接有一种称作VPg的病毒蛋白并在3’-末端具有一个聚腺苷酸尾。该多病毒基因组的表达策略包括翻译成为一种大型多蛋白,该蛋白由病毒蛋白酶进行加工以得到最终的病毒蛋白产物。
发明概述总体上,本发明涉及到提供一种抗兔出血性疾病病毒的重组疫苗的问题,特别是生产一种可被用作为抗所述的疾病的疫苗的抗原。
本发明所提供的解决方案基于RHDVVP60结构抗原或其片段在植物中的生产,该生产使用一种基于
PPV病毒的病毒载体,具体来说是一种PPV-NK表达载体。这些抗原的产生在实施例1中阐示,而所获得的这些抗原在兔体内诱导抗RHDV的致死性侵袭的保护的能力在实施例2中阐示。
基于PPV病毒的载体的应用所遵循的表达策略基于一种多蛋白的产生,该多蛋白随后经病毒蛋白酶的加工而产生最终的病毒蛋白产物,该载体的应用所提供的优势在于所有的蛋白,包括异源蛋白以相同的量进行合成,并且积累水平上的差异完全取决于它们在被感染的植物体内或者植物细胞内的稳定性。
因此,本发明的一个主题是一种方法,该方法用于RHDVVP60结构抗原或其片段在可被PPV病毒感染的植物体内或者植物细胞内的生产;这包括了构建基于PPV病毒的RHDVVP60结构抗原或其片段的表达载体的步骤,该载体包含有编码RHDVVP60抗原或其片段的核苷酸序列,该序列插入于编码PPV病毒的NIb和CP蛋白的核苷酸序列之间。RHDVVP60抗原或其片段的这种基于PPV病毒的表达载体也是本发明的另一个主题。
本发明的另一个额外的主题是一种可被PPV病毒感染的植物题或者植物细胞,该PPV病毒包含所述的基于PPV病毒的RHDVVP60抗原或其片段的表达载体。
本发明的另一个主题为一种抗兔出血性疾病的重组亚基疫苗,该疫苗包含所述的在植物中使用所述的基于
PPV病毒的表达载体而获得的RHDVVP60抗原或其片段。所述的重组亚基疫苗的生产过程为本发明的另一个主题。
附图简述
图1所示为使用抗RHDV60蛋白多克隆血清进行的对来自于Nicotianaclevelandii植物的提取物的蛋白印迹测试,该植物被接种以PPV-NK-VP60(泳道1-15)或者野生型的PPV(泳道16)。在泳道3、5、8和14的植物无症状(数据未出示)。在泳道3和8中的条带可能是由于相邻孔内的溢出所致,所使用的分子量标记(BioRad)在该板边侧显示。
发明详述本发明提供了RHDVVP60抗原或其片段的一种基于PPV病毒的表达载体,称之为本发明的表达载体,该载体包含-一个启动子
-一个重组DNA序列,该序列包含有PPV基因组的全长cDNA以及一个编码RHDVVP60蛋白或其片段的DNA序列,该序列插入于编码PPV的蛋白质NIb与CP的核苷酸序列之间,以及-一种克隆载体在本说明书中所使用的术语“RHDVVP60抗原(或者蛋白)或其片段”指的是一种蛋白质,该蛋白质包括来自任何一种分离株RHDV的全部或者部分的VP60,该VP60能够与T细胞受体或者抗体进行特异性的结合。在一个特定的实施方案中,所述的蛋白能够激发接受该蛋白给药的动物体内的免疫应答。术语“全长”指的是一种完整基因组序列,并且
RHDVVP60的变体在能够激发该免疫应答的情况下被包含于在该定义中,这些变体因氨基酸的添加、取代或者缺失而有别于天然蛋白。
启动子启动子或者转录启动子序列为一种定位于5’-末端并且直接在PPV病毒的cDNA的1号核苷酸之前的DNA序列,RNA聚合酶同其相结合以起始RNA转录。所述的启动子可能为-一种用于cDNA通过相应的RNA聚合酶进行体外转录的适当的启动子,例如噬菌体启动子,如T7噬菌体;或者-植物中的某种功能基因的启动子,适用于病毒RNA的体内转录,例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。
重组DNA序列重组DNA序列存在于本发明的表达载体中,该DNA序列包含一个PPV病毒基因组的全长cDNA以及一个编码RHDVVP60蛋白或其片段的DNA序列,该序列插入于编码PPV病毒的NIb与CP蛋白质的核苷酸序列之间,以使由所述的RHDVVP60蛋白或其片段的编码序列所编码的产物在相应的宿主中通过形成PPV多蛋白中所述的NIb和CP蛋白之间的部分而表达,同时在病毒蛋白质中不产生任何变化,从而对病毒功能造成尽可能小的干扰。天然的蛋白酶NIa负责将RHDVVP60蛋白或者片段同病毒产物的其余部分相分离。
通过对PPV病毒的全长cDNA克隆进行操作可获得重组DNA序列,该重组DNA序列包含一个PPV病毒基因组的全长cDNA以及一个编码RHDVVP60蛋白或其片段的DNA序列,该序列插入于编码
PPV的蛋白质NIb与CP的核苷酸序列之间,。
为辅助编码RHDVVP60蛋白或者其片段的DNA序列在PPV病毒的cDNA适当位置的插入,来自PPV病毒的全长cDNA克隆可通过传统的遗传工程技术进行操作从而向NIb和CP病毒蛋白的编码核酸序列之间引入一个核苷酸序列,该序列由以下元件组成,这些元件按照以下的次序可操作地连接(根据编码链的5’→3’方向)a)一种核苷酸外源序列,该序列选自i)一种18个核苷酸的外源序列,该序列组成了NIb蛋白的编码序列的最后18个核苷酸并且该序列编码了来自PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的前6个氨基酸,以及ii)一种21个核苷酸的外源序列,该序列编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽;b)一种核苷酸序列,该序列具有第一种限制性酶的单一的识别位点;c)由至少3个任意类型的核苷酸组成的第二个间隔序列,以便促进该限制性酶的锚定以及增强其效率;以及d)一种核苷酸序列,该序列具有第二种限制性酶的单一的识别位点。
根据这一建构,在PPV病毒的NIb和CP蛋白的顺反子之间具有两个核苷酸序列,该序列编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽,并且在这两个核苷酸序列之间具有第一种限制性酶的靶点以及第二种限制性酶的靶点,它们均为单一位点。该外源七肽可以是,例如,七肽
NVVVHGA,其为PPV的NIa蛋白酶的一个位于PPV的NIb和CP蛋白之间的识别位点。
在一个特定的实施方案中,所述的PPV的NIa蛋白酶的外源识别序列由以下的组合形成(i)18个核苷酸的外源序列,该核苷酸序列构成编码NIb蛋白的最后18个核苷酸并且编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的前6个氨基酸,以及(ii)第一种限制性酶的识别序列的前3个核苷酸,它们编码了所述的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的最后一个氨基酸,而编码所述的PPV的NIa蛋白酶的识别序列的其它核苷酸序列如下形成(i)紧邻于编码CP蛋白的核苷酸序列的18个核苷酸,它们原本对应于编码PPV的NIb蛋白的羧基末端的最后6个氨基酸的最后18个核苷酸,该序列组合于(ii)CP蛋白编码序列的前3个核苷酸,它们编码了所述的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的最后一个氨基酸。
在另一个特定的实施方案中,所述的PPV的NIa蛋白酶的识别序列由所述的21个氨基酸的外源序列形成,该外源序列编码PPV的NIa蛋白酶的识别七肽,而编码所述的PPV的NIa蛋白酶的识别序列的另一个核苷酸序列如下形成(i)紧邻于编码CP蛋白的核苷酸序列的18个核苷酸序列,该序列原本对应于编码PPV的NIb蛋白的羧基末端的最后6个氨基酸的最后18个核苷酸,该序列组合于(ii)CP蛋白编码序列的前3个核苷酸,它们编码了所述的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽的最后一个氨基酸。
在本发明的一个特定的和优选的实施方案中,编码PPV的NIa蛋白酶的两种识别序列的核苷酸序列是不同的,并且它们在一个或者多个核苷酸上有所差异,其目的在于防止或者减少同源序列之间的可能的重组现象,该现象可导致编码异源蛋白的核苷酸序列的丢失。在一个特定的实施方案中,所述的核苷酸序列编码位于NIb和CP蛋白之间的PPV的NIa蛋白酶的识别七肽,并且它们在各个三联体中至少有一个核苷酸的差异。
两种限制性酶识别靶点或者序列向PPV病毒的全长cDNA克隆中的引入允许了编码RHDVVP60蛋白或其片段的的克隆。一般情况下,所述的第一种和第二种限制性酶可为任何限制性酶。在一个特定的实施方案中,第一种限制性酶的靶点为NaeI酶的靶点,该靶点紧邻于编码PPV的NIb蛋白的羧基末端的序列。在另一个特定的实施方案中,第二种限制性酶的靶点为不同于所述的第一种限制性酶的靶点,例如KpnI酶的靶点。
为获得鉴定为pUC18-NK和pICPPV-NK的克隆而进行的对PPV病毒的cDNA全长克隆的操作在先前有所描述(上文给出的Fernández-Fernández,1999)。
克隆载体克隆载体为一种DNA分子,该分子具有复制起点并因此而能够在适当的细胞中复制。
本发明的表达载体的获得本发明的表达载体可通过一种过程而获得,该过程包括以限制性酶消化来自PPV病毒的全长cDNA(经操作处理以向编码PPV病毒的NIb和CP蛋白的核苷酸之间引入前述的核苷酸序列a)-d)),该限制性酶的识别位点位于所述的被操作的cDNA克隆之中,该过程还包括将编码RHDVVP60或其片段的序列进行连接并且将所述的PPV的重组DNA序列插入一种克隆载体之中,该重组DNA序列含有RHDVVP60或其片段,该序列任选处于一种适当的启动子的控制之下。
实施例1描述了一种基于PPV病毒的RHDVVP60抗原的表达载体的构建。
本发明还在本发明的一个进一步的程序中提供了一种方法,该方法用于在可被PPV感染的植物体内或者植物细胞内获得RHDVVP60蛋白或其片段,该方法包括1)以本发明的表达载体对所述易感于PPV感染的植物体或者植物细胞进行接种;2)在所述的植物体或者植物细胞内表达处于病毒多蛋白中的所述的RHDVVP60蛋白或其片段;并且,任选,3)通过对所述的多蛋白进行蛋白水解加工而从病毒多蛋白中分离所述的RHDVVP60蛋白或其片段。
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