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专利名称:免疫治疗和诊断结核病的化合物和方法
技术领域:
本发明一般涉及检测,治疗和预防结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染。本发明更特别地涉及包含结核分枝杆菌抗原,或者其部分或其其它变体的多肽,以及这样的多肽对结核分枝杆菌感染进行诊断和接种疫苗的用途。
背景技术:
结核病是慢性感染病,其一般是由结核分枝杆菌感染引起的。其是发展中国家的一种主要的疾病,而且在世界的发展地区出现越来越多的问题,每年大约8百万新的病例和3百万死亡。尽管感染可能在相当一段时间是无症状的,但是该疾病最通常表现为肺部急性炎症,导致发烧和干咳。如果不加以治疗,一般导致严重的并发症和死亡。
尽管结核病一般可以使用扩大的抗生素治疗来控制,但是这样的治疗不足以防止疾病的蔓延。感染的个体可能是无症状的,但是在一定时间是接触传染的。另外,尽管治疗方案的顺应性是严格的,但是患者的行为是难以监控的。一些患者不完成治疗期,这导致没有效果的治疗和产生抗药性。
抑制结核病的蔓延需要有效的疫苗接种和疾病的准确,早期的诊断。最近,用活细菌接种是诱导保护性免疫的最有效的方法。用于该目的的最普通的分枝杆菌是芽孢杆菌
Calmette-Guerin(BCG),一种牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)的减毒株。但是BCG的安全性和效力是争论之话题,而且在一些国家,例如在美国,一般公众不接种。诊断一般用皮试完成,其涉及真皮内暴露给结核菌素PPD(蛋白质纯化的衍生物)。注射后48-72小时在注射点抗原特异性T细胞应答产生可测的硬结,其表明暴露在分枝杆菌抗原之下。但是该试验的问题是敏感性和特异性,并且接种BCG的个体不能和感染的个体区分开来。
巨噬细胞表现出作为结核分枝杆菌免疫的主要效应子而起作用,而T细胞是这样的免疫的主要的诱导物。T细胞在抗结核分枝杆菌感染的保护中的主要作用通过由于与人免疫缺陷病毒(HIV)感染相关的CD4T细胞的缺失而在AIDS患者中频繁发生结核分枝杆菌来说明。分枝杆菌-反应性CD4T细胞表现出是γ-干扰素(IFN-γ)的潜在的生产者,而后者接着表现出在小鼠内触发巨噬细胞的抗分枝杆菌作用。尽管IFN-γ在人体内的作用尚不十分清楚,但是研究表明1,25-二羟基-维生素D3,单独地或者与IFN-γ或者α-肿瘤坏死因子组合,激活人巨噬细胞抑制结核分枝杆菌感染。此外,已知IFN-γ刺激人巨噬细胞产生1,25-二羟基-维生素D3。类似地,IL-12表现出在刺激对结核分枝杆菌感染的抗性中起作用。关于结核分枝杆菌感染免疫学的综述参见Chan和
Kaufmann,结核病发病机理,保护和治疗Tuberculosis;Pathogenesis,ProtectandControl,Bloom(编著),ASM出版,华盛顿,DC,1994。
因此,本领域存在对于改进的疫苗和预防,治疗和诊断结核病的方法的需要。本发明满足了这些需要,并且进一步提供了其它相关的优点发明概述简要地说,本发明提供用于预防和诊断结核病的化合物和方法。一方面,提供的多肽包含可溶性结核分枝杆菌抗原或者这样的抗原的变体的免疫原性部分,所述抗原的变体只是在保守性替换和/或修饰上不同。在该方面的实施方案中,该可溶性抗原具有下面N-末端序列之(a)Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu;()(b)Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser;()(c)Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg;()(d)Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro;()
(e)Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val;()(f)Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro;()(g)Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser
;()(h)Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly;()(i)Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn;()(j)Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser;()(k)Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp;()或(l)Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly;()其中Xaa可以是任何氨基酸。
在相关的方面,提供的多肽包含结核分枝杆菌抗原或者这样的抗原的变体的免疫原性部分,所述抗原的变体只是在保守性替换和/或修饰上不同。抗原具有下面N-末端序列之一(m)Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val;()或(n)Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe;()其中Xaa可以是任何氨基酸。
在另一个实施方案中,,2,4-10,13-25,52,99和101列出的序列,,2,
4-10,13-25,52,99和101列出的序列或其互补序列杂交的DNA序列的DNA序列编码的氨基酸序列。
在相关的方面,该多肽包含结核分枝杆菌抗原或者这样的抗原的变体的免疫原性部分,所述抗原的变体只是在保守性替换和/或修饰上不同,-51,138,139,163-183和201列出的序列,-51,138,139,163-183和201列出的序列或其互补序列杂交的DNA序列的DNA序列编码的氨基酸序列。
在相关的方面,也提供了编码上述多肽的DNA序列,包含这些DNA序列的表达载体和用这样的表达载体转化或转染的宿主细胞。
另一方面,本发明提供融合的蛋白质,其包含第一和第二本发明多肽,或者本发明多肽和已知的结核分枝杆菌抗原。
在其它方面,本发明提供含有一种或多种上述多肽,或者编码这样的多肽的DNA分子,和药学可接受载体的药物组合物。本发明还提供包含一种或多种如上所述多肽和非特异性免疫应答增强剂的疫苗,以及含有一种或多种编码这样的多肽的DNA序列和非特异性免疫应答增强剂的疫苗。
在又一方面,提供诱导患者保护性免疫的方法,包括给予患者有效量的一种或多种上述多肽。
在本发明又一方面,提供检查患者结核病的方法和诊断盒。该方法包括用一种或多种上述多肽接触患者的皮细胞,并且检查患者皮肤上的免疫反应。诊断盒包括一种或多种上述多肽和足以使多肽接触患者的皮细胞的设备。
另外方面中,提供检查患者结核病的方法,,11,12,140,141,156-160,189-193,199,200和203的序列,所述序列的互补序列,,11,12,140,141,156-160,189-193,199,200和203列出的序列杂交的DNA序列编码的一种或多种多肽接触患者皮细胞;并且检查患者皮肤上的免疫反应。也提供了在这样的方法中使用的诊断盒。
参照下面的详细描述和附图,本发明的这些和其它方面将变得显而易见。这里所公开的全部参考其全部引作参考,好象其各自引作参考一样。
附图和序列鉴定的简要说明
图1A和B详细说明实施例1描述的14Kd,20Kd和26Kd抗原分别对来自第一和第二结核分枝杆菌免疫供者的T细胞的增殖和干扰素-γ产生的刺激作用。
图2详细说明两种代表性多肽TbRa3和TbRa9对来自结核分枝杆菌免疫个体的T细胞中的增殖和干扰素-γ产生的刺激作用。
图3A-D详细说明结核分枝杆菌裂解物(泳道2),结核分枝杆菌分泌蛋白(泳道3),重组体Tb38-1(泳道4),重组体TbH-9(
泳道5)和重组体85b(泳道5)分别抗分泌性结核分枝杆菌蛋白,已知的结核分枝杆菌抗原85b和本发明抗原Tb38-1和TbH-9抗血清反应性。
图4A详细说明分泌性结核分枝杆菌蛋白,重组体TbH-9和对照抗原TbRa11对TbH-9-特异性T细胞克隆增殖的刺激作用。
图4B详细说明分泌性结核分枝杆菌蛋白,PPD和重组体TbH-9对TbH-9-特异性T细胞克隆中干扰素-γ产生的刺激作用。
图5A和B详细说明融合蛋白TbH9-Tb38-1对TbH-9-特异性T细胞中增殖和干扰素-γ产生的刺激作用。
图6A和B详细说明融合蛋白TbH9-Tb38-1对Tb38-1-特异性T细胞增殖和干扰素-γ产生的刺激作用。
图7A和B详细说明融合蛋白TbH9-Tb38-1对先前表现出对TbH-9和Tb38-1两者应答的T细胞增殖和干扰素-γ产生的刺激作用图8A和B详细说明代表性多肽XP-1,RDIF6,RDIF8,RDIF10和RDIF11对来自第一结核分枝杆菌免疫个体的T细胞增殖和干扰素-γ产生的刺激作用。
图9A和B详细说明代表性多肽XP-1,RDIF6,RDIF8,RDIF10和RDIF11对来自第二结核分枝杆菌免疫个体的T细胞增殖和干扰素-γ产生的刺激作用。
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-23的DNA序列。
-24的DNA序列。
-25的DNA序列。-28的DNA序列。-29的DNA序列。-5的DNA序列。-8的DNA序列。-9的DNA序列。-1的DNA序列。-3的DNA序列。-6的DNA序列。-7的DNA序列。-9的DNA序列。-12的DNA序列。-13的DNA序列。-14的DNA序列。-15的DNA序列。-4的DNA序列。-4-FWD的DNA序列。-12的DNA序列。-1的DNA序列。-4的DNA序列。-17的DNA序列。-20的DNA序列。-21的DNA序列。-16的DNA序列。。。-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。
AAMKN-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。-末端抗原的蛋白质序列。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。