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修饰的肠激酶轻链的制作方法
本发明涉及新的哺乳动物肠激酶类似物例如哺乳动物肠激酶轻链类似物和制备其的方法。本文还描述了用于切割具有肠激酶切割位点的蛋白质的方法。
【专利说明】修饰的肠激酶轻链
【技术领域】
[0001]本发明涉及新的哺乳动物肠激酶类似物,制备这种物质的方法和所述哺乳动物肠激酶类似物用于切割具有肠激酶切割位点的蛋白质中的用途。
[0002]通过引用对序列表的合并
序列表,标题为“序列表”,为10kb,创建于2012年12月17日,通过引用合并入本文。
[0003]背景
丝氨酸蛋白酶肠激酶(enterokinase)(简称肠激酶或EK),也被称为肠肽酶(enteropeptidase),是异二聚糖蛋白,一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys((Asp)4-Lys,DDDDK),其中它选择性地在赖氨酸之后切割。从牛十二指肠粘膜中分离的肠激酶展示150,000的分子量(MW)和35%的糖含量(carbohydratecontent)。该酶由重链(MW~115,000)和二硫键连接的轻链(MW~35,000)组成(Li印nieks等,
.,254(5):1677-1683(1979))。重链的功能是将酶固定在粘膜的膜上。轻链充当催化亚基。
[0004]在大肠杆菌()中,许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白,其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了该目的需要有加工酶,优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的加工酶。肠激酶是这样的酶,而且已经进行了许多努力以在大肠杆菌中确定重组方法以获得肠激酶或肠激酶类似物。但是,到目前为止结果仍然相当贫乏:可获得的商业产品价格昂贵且特异性活性较低,这是由于沉淀的EK的无效复性或可溶的EK的无效分泌造成的。
[0005]大肠杆菌中针对可溶性EK产品的方法导致可溶性和不溶性蛋白的混合物,需要2种纯化路线,昂贵的亲和柱,并且总之产量较低。为了获得均一的产品,EK必须被产生为包含体形式的不可溶物质。它们易于分离但是难以以令人满意的产量复性,这是由于蛋白可能聚集。
[0006]本发明的目的是获得具有改进性质的哺乳动物肠激酶类似物。
[0007]简述
本发明涉及在合适位点突变的哺乳动物肠激酶类似物。本发明的肠激酶类似物相对于亲本(野生型)哺乳动物肠激酶中氨基酸的一个或多个替换可以例如是疏水氨基酸被亲水的、带电荷的氨基酸替换。
[0008]在本发明的一个方面,获得的牛肠激酶轻链类似物包含在位置134和/或135上的至少一个由疏水氨基酸向亲水带电荷氨基酸的替换。在一个方面,根据本发明的牛肠激酶轻链类似物进一步包含在位置112上的替换。
[0009]本发明还涉及在肠激酶轻链类似物的复性过程中获得提高的溶解性的方法。在一个方面,该方法包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸的步骤,以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤,其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。
[0010]在一个方面,本发明提供用于获得哺乳动物肠激酶类似物的改进的生产方法。另外或者可选地,在第二个方面,本发明提供改进的生产方法,其导致产量提高。
[0011]在本发明的一个方面,生产牛肠激酶轻链类似物的方法包括以下步骤:
a)在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包含编码肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列;
b)回收具有包含体形式的肠激酶轻链的细胞
c)溶解并再折叠肠激酶轻链类似物;以及
d)纯化肠激酶轻链类似物。
[0012]在一个方面,本发明提供在细菌或酵母宿主细胞中重组生产肽或蛋白质的方法。在一个方面,所述方法包括
:
a)在酵母或细菌中表达包含要被生产的肽或蛋白质的融合蛋白;
b)用根据方面1-9任一项的牛肠激酶轻链类似物切割所述融合蛋白;以及
c)分离产生的肽或蛋白。
[0013]本发明还可以解决随着示例性的实施方案的公开将会显而易见的其它问题。
[0014]附图简述
图1=Trx-EI^(A)和Trx-EKui⑶表达对诱导时间的依赖。M:标志物;B1:诱导前;12,13,14和16分别代表1PTG的诱导时间(小时);15%凝胶;使用发酵确定成分培养基(Fermentationdefinedmedium,FDM)。
[0015]图2:EK纯化的流程图
图3:再折叠过程中的再折叠%产量(图3A)和IL再折叠缓冲液中纯化的E&和EKui的量(mg,图3B)作为Trx-连接肽-EKl和Trx-连接肽-EKui浓度的函数。▲/Λ:Trx-连接肽-EKl,lmg/ml包含体(IB);./O:Trx-连接肽-EKlil,6mg/mlIB:Trx-连接
肽-EKlM,4mg/mlIB。-连接肽-EKui或Trx-连接肽-EKl的细胞沉淀被裂解且包含体被溶解至不同的浓度,即在含有20mMTris,8M脲,,20mMDTT的缓冲液中
Trx-连接肽-EKlj为lmg/ml,Trx-连接肽-EKlil为4mg/ml或6mg/ml。在含有20mMTris,IM脲,ImMGSSG,3mMGSH,°C温育24小时后,如实验部分所述用QHP层析对EKui/EKl进行纯化。
[0016]图4:Trx-EKL的再折叠产量随着温育时间而增加。-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mMTris,8M脲,,。在含有20mMTris,IM脲,ImMGSSG,3mMGSH,°C分别温育24小时或48小时后,如实验部分所述检测酶活性。
[0017]图5:再折叠产量对脲浓度的依赖。-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mMTris,8M脲,,。在含有20mMTris,ImMGSSG,3mMGSH,,,ImM,°C温育24小时后,如实验部分所述检测酶活性。
[0018]图6:再折叠产量对氧化还原GSSG/GSH比例的依赖。-EKL的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mMTris,8M脲,,。在含有20mMTris,IM脲,°C温育24小时后,如实验部分所述检测酶活性。
[0019]图7:通过QHP层析纯化ΕΚ?Μ。㈧:层析谱。EKui通过钠梯度洗脱,如P2中所示。含有EK酶活性的级分被标示出。⑶:还原条件下每一步的EKui的SDS-PAGE。EKu1:通过疏水相互作用层析进一步纯化P2获得的高纯度EKui(>90%);M:标志物,B1:诱导前,Total:总裂解物;Sup:细胞裂解后的上清;IB:进行再折叠和纯化的包含体;App:再折叠和自活化之后应用于QHP柱的样品;Pl,P2和P3代表图7A中标出的每个峰的合并级分。(C):酶活性。Λ:;.:,Iul稀释的样品加入到IOOul反应缓冲液中;〇:;:(20mMTris,)加入到IOOul反应缓冲液中。-EKui的细胞沉淀被裂解且包含体在含有20mMTris,8M脲,,20mMDTT的缓冲液中溶解至4mg/ml。在含有20mMTris,IM脲,ImMGSSG,3mMGSH,°C温育24小时后,如实施例部分所述用QHP层析对EKui进行纯化。
[0020]图8=EKl和EKlm之间相似的特异性酶活性。25EU的纯化的EKl和EKui被加样到SDS-PAGE上。
[0021]图9=EKlm在_80°C或4°C稳定至少3个月。如实施例部分所述纯化的EKui被等分并储存于_80°C或4°C。3
个月后,取自每种温度的5PgEKlm在还原和非还原条件下被加样到SDS-PAGE上,并与新鲜纯化的EKlm(新鲜)相比较。
[0022]图10:氨基酸序列trxEKLM(SEQIDNo:9)和trx-连接肽-EKlm(SEQIDNo:8)的比较。在trx-连接肽-EKlm中,trx和EKLM之间的间隔肽比trxEI^长37个氨基酸。
[0023]图11=Trx-连接肽-EKui的再折叠效率随加入到再折叠缓冲液中的PEG1000或环糊精而增加。。再折叠缓冲液中PEG1000和环糊精的最终浓度分别为1%%。
[0024]描述
本发明涉及在合适位点突变的哺乳动物肠激酶类似物。本发明的肠激酶类似物相对于亲本(野生型)哺乳动物肠激酶中氨基酸的一个或多个替换可以例如是疏水氨基酸被亲水的、带电荷的氨基酸替换。在一个方面,本发明的哺乳动物肠激酶类似物相对于野生型牛肠激酶的氨基酸的一个或多个替换是由疏水氨基酸向亲水带电荷氨基酸的替换。在一个方面,进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型哺乳动物肠激酶轻链例如折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。
[0025]野生型牛肠激酶轻链通常在宽的pH范围(-)和温度范围(4-45°C)内在存在各种去垢剂和变性剂的条件下表现出良好的活性。因此,肠激酶轻链已在生物技术中作为一种有力的工具被用于融合蛋白的体外切割中。
[0026]但是,从动物例如猪和牛中提取的复杂生产方法和低生产产量限制了EK在生物技术中的应用。近来,已通过活性肠激酶轻链的分泌或通过无活性肠激酶轻链的包含体的胞内聚集、再折叠和活化在大肠杆菌中获得重组肠激酶轻链。而且已证明牛肠激酶轻链的Cysll2替换为Ala增加酶活性,大概是由于其促进了再折叠。在全酶中Cysll2连接轻链和重链,且其不是轻链的必要部分。
[0027]在本发明的一个方面,哺乳动物肠激酶类似物是哺乳动物肠激酶轻链类似物例如牛肠激酶轻链类似物。在本发明的一个方面,哺乳动物肠激酶类似物是牛肠激酶轻链类似物。在根据本发明的一个方面,牛轻链类似物包含在位置134和/或位置135上的一个或多个替换。在一个方面,牛肠激酶轻链类似物包含在位置112、134和/或135上的替换。在一个方面,牛肠激酶轻链类似物包含至少两个替换。在一个方面,牛肠激酶轻链类似物包含至少三个替换。在一个方面,牛肠激酶轻链类似物包含在位置112、134和135上的替换。在一个方面,牛肠激酶轻链类似物包含替换C112A、L134K和I135K。
[0028]本发明的新的牛肠激酶轻链类似物包括具有野生型牛肠激酶轻链的一级结构构象(即氨基酸序列)的那些。野生型牛肠激酶轻链具有基本如SEQIDNO:1所示的序列。
【权利要求】
,其包含在位置134和/或135上的至少一个替换,所述替换是疏水氨基酸被亲水带电荷氨基酸替换。
,其进一步包含在位置112上的替换。
,其中所述一个或多个亲水带电荷氨基酸是选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的一个或多个氨基酸。
,其中被突变的肠激酶轻链是SEQIDNO:1。
,包括将野生型牛肠激酶轻链的一个或多个疏水氨基酸突变为亲水氨基酸以及任选地将野生型牛肠激酶轻链的其它氨基酸进行突变的步骤,其中进行突变的疏水氨基酸位于折叠的野生型牛肠激酶轻链的表面上。
,其中被突变的一个或多个疏水氨基酸选自1、V、L、M、W、F、A0
-6任一项的方法,其中所述亲水氨基酸选自由赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组。
-7任一项的方法,其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于选自位置11-14(氨基酸AWPW)、位置78-80(氨基酸IVI)和位置133-136(氨基酸ALIY)的一个或多个位置。
,其中被突变的一个或多个疏水氨基酸位于位置134和/。
,其中所述方法包括以下步骤:a)在包含诱导物的生长培养基中培养宿主细胞,其中所述宿主细胞包含编码所述肠激酶轻链类似物的氨基酸序列的多核苷酸序列;b)回收具有包含体形式的肠激酶轻链类似物的细胞c)溶解并再折叠所述肠激酶轻链类似物;以及d)纯化所述肠激酶轻链类似物。
,其中所述牛肠激酶轻链类似物是根据权利要求1-4任一项的类似物。
,包括a)在酵母或细菌中表达包含要产生的肽或蛋白质的融合蛋白;b)用根据权利要求1-4任一项的牛肠激酶轻链类似物切割所述融合蛋白;以及c)分离产生的肽或蛋白质。
,其中步骤a)中表达的融合蛋白进一步包含Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点。
-13任一项的重组产生肽或蛋白质的方法,其中所述宿主细胞是大肠杆菌。