修饰的羧肽酶的制作方法.docx

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专利名称:修饰的羧肽酶的制作方法
背景技术:
一种生产肽,特别是药用肽的优选方法是借助遗传工程。然而,通过重组技术生产肽有特殊的限制。例如,因为遗传密码不包括非天然存在的L-氨基酸、D-氨基酸、放射性氨基酸和其它可检测到的标记,所以带有这些修饰的重组多肽的生产是困难的。
并且,通常在体内形成的天然氨基酸修饰如C末端酰***基团转换难以在体外形成。因为这些翻译后修饰常常产生肽最强或最长的作用形式,所以它们是对于药用最需要和最理想的形式。对许多多肽而言,C末端酰***化作用对生物活性是重要的。然而,大规模活性多肽生产的重组表达系统并不易于进行所需要的C末端修饰。
已知羧肽酶可催化转肽反应,产生C末端酰***化的多肽。然而,野生型羧肽酶对许多多肽的C末端酰***化作用是无用的。例如,野生型羧肽酶固有的底物特异性限制了使用此酶可修饰的多肽种类。
特别地,羧肽酶Y表现出对含有次末位非极性残基的多肽的强烈偏爱。含有具有带正电侧链的次末位氨基酸的底物不能由羧肽酶Y有效转酰基。例如,水解底物FA-Arg-Ala-OH比水解底物FA-Leu-Ala-OH慢500倍。遗憾的是,许多药学上重要的多肽包括生长激素释放因子
(GRF)或胰高血糖素样肽(GLP1)的氨基酸序列都含有具有带正电侧链的次末位或最末位氨基酸,使得羧肽酶Y的转酰***基作用在商业上不实用。
尽管已知的一些突变羧肽酶对大量肽底物有增强的水解活性,但是对大量突变羧肽酶的研究证明在具有增强的水解活性的突变体和具有增强的转酶***基活性的突变体之间没有特异的联系。例如,尽管来自微紫青霉的羧肽酶S1能有效水解含有碱性P1残基的肽底物,但是酶并不能对它们有效地发挥转肽作用。引自Breddam,.,53(5)309-320(1988)。
提供对序列上包含具有带正电侧链的次末位氨基酸(P1)的肽底物有增强的转酰基活性的修饰羧肽酶是十分有用的。
发明概述本发明提供修饰的羧肽酶和转酰***基的方法。修饰的羧肽酶和方法有效地改善羧肽酶Y对序列中包含具有带正电侧链的次末位氨基酸(P1)的肽底物的转酰基活性。
本发明的修饰的羧肽酶包含在其S1亚位点(Subsite)的至少一个氨基酸替换。导致与天然羧肽酶相比在S1亚位点更多的负电荷。典型地,这通过用具有带负电侧链的氨基酸残基替换具有中性或带正电侧链的氨基酸残基来实现。S1亚位点内用于引入负电荷的优选位点的实例包括L178、W312、N241和L245位。具有带负电氨基酸侧链的氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。修饰的羧肽酶Y也可包含其它突变,例如在一个或多个羧肽酶的
S1’,S2和S3亚位点的氨基酸残基替换。这些额外的修饰能进一步增强对特殊底物的转酰基作用,并使底物和亲核物质适应转酰***反应。
本发明的方法包括在修饰的羧肽酶Y的参与下使肽底物与亲核物质反应。适当的亲核物质的实例包括烷基***、苯******和氨基酸的α-氨基。氨基酸亲核物质可以酸、酯或酰***形式含有α-羧化物。优选地,。
本发明的另一方面包括含有至少一个用具有带负电侧链的氨基酸替换的氨基酸残基N241和L245的修饰的羧肽酶Y。优选地,修饰的羧肽酶Y也包含在S1亚位点内的其它替换,最优选地在L178和/或W312位。修饰的羧肽酶Y可进一步包含在一个或多个羧肽酶亚位点S1’、S2和S3内氨基酸残基处的氨基酸替换。
本发明的修饰的羧肽酶对重组肽,特别是含有具有带正电侧链的次末位氨基酸的肽的翻译后修饰特别有用。然而,可以理解通过重组技术之外的方法产生的肽可以按照本发明的方法进行转酰***基作用。发明详述本发明的修饰的羧肽酶设计为改善或增强含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物的转酰***基作用。优选修饰的羧化酶是从已知的丝氨酸或半胱氨酸羧肽酶如羧肽酶Y衍生而来。
为易于理解本发明,将首先提供与本发明相关的所用术语的简短讨论。术语本公开使用
Schechter等,1967,-162中的术语来描述肽底物上和羧肽酶活性位点内不同氨基酸残基位置。
根据Schechter等的术语,肽底物的氨基酸残基用字母“P”表示。底物中肽键切割(即“切割点”)N末端侧的氨基酸用Pn…P3、P2、P1表示,其中Pn表示离切割点最远的氨基酸残基。肽底物中切割点C末端侧的氨基酸残基用P’1、P’2、P3’…Pn’表示,其中Pn’表示离切割点最远的氨基酸残基。因此,要切割的键(即“切割点”)是P1…P1’键。因为羧肽酶仅切割C末端的次末位残基间的多肽键,所以羧肽酶的底物仅包括C末端侧P1’位的残基(即没有P2’,P3’等残基)。羧肽酶底物氨基酸的基本结构式如下Pn------P3---P2---P1-----P1’羧肽酶的“活性位点”可分为多个底物结合亚位点。羧肽酶底物结合亚位点的表示与肽底物氨基酸残基的表示方法类似。但是,羧肽酶的结合亚位点用字母“S”表示并且可包括一个以上氨基酸残基。在切割点N端位点的氨基酸残基的底物结合位点标记为Sn…S3、S2、S1。切割点羧基侧的氨基酸的底物结合亚位点用S1’表示。因此,在羧肽酶中,S1’亚位点与肽底物的“离去基团”和进入的亲核物质相互作用。描述羧肽酶底物结合位点的基本结构式是Sn------S3---S2---S1---S1’S1结合位点结合肽底物的次末位氨基酸P1的侧链。S2结合位点与相邻氨基酸残基P2的侧链相互作用。同样的,
S3结合位点与P3残基的侧链相互作用。
如此处所用的,亲核物质是向电子受体提供一对电子,在此例中是肽底物次末位氨基酸残基的α-羧化基团酰基碳,以形成共价键的分子。适当的亲核物质包括氨基酸、氨基酸衍生物如氨基酸酯和氨基酸酰***、酰***如氨或苯******。适合用于本方法的化合物的一个特异基团包含可切割的亲核物质(在转酰***基反应之后的步骤中)以产生缺乏衍生于亲核物质的残基并具有C末端羧酰***的肽。实例包括可通过光解作用(solvalysis)、溶剂分解作用、还原作用、重排作用、水解或氧化作用切割的亲核物质,如那些在美国专利号5,580,751中公开的那些物质,在此引用作为参考。应当指出底物肽的次末位氨基酸在C末端残基已从转酰***基产物上切割下来后成为最末位残基。
本发明包括从已知的丝氨酸或半胱氨酸羧肽酶衍生的“修饰的羧肽酶”,其中已用不同氨基酸替换某些氨基酸残基以提供能改善转酰***基作用的羧肽酶。“改善的转酰***基作用”可通过测量得到的氨解比例(fa)来检验。
因为氨解的低比例可能是由于转酰***基产物通过水解降解,(fa)是更优选的。
另一个有用的酶效力测量标准是KN(app),即达到fa最大/2时的酶浓度。KN(app)描述了亲核物质的表观结合常数。因为竞争性水解反应主要在离去基团仍结合于酶上时发生,所以
KN(app)是优选的。转酰***基作用本发明的修饰羧肽酶与相应的羧肽酶相比能改善在P1亚位点具有带正电氨基酸残基的肽底物的转酰***基作用。如此处所用的,“转酰基作用”是其中离去基团替换为亲核物质的反应。转酰基反应包括转酰基作用和转肽反应。“转肽作用”,如此处所用的,在氨基酸或氨基酸衍生物作用为离去基团并且亲核物质是氨基酸或氨基酸衍生物如氨基酸酯或氨基酸酰***时发生。“转酰***基作用”包括转肽作用,其中在亲核物质和肽底物之间形成酰***键。但是,在转酰***基反应中,亲核物质不必需是氨基酸。基本转酰基反应如下所示
根据本发明,肽底物可在修饰的羧肽酶的参与下与亲核物质反应以形成其中亲核物质通过酰***键与肽底物P1残基的α-羧基连接的产物。通过丝氨酸羧肽酶进行的C末端酰基化作用是两步反应。在第一步中,酶攻击C末端肽键,置换P1’“离去基团”并在肽底物P1残基和酶之间形成酰基键。此中间产物称为“酰基-酶中间体”。在适当亲核物质的参与下,在适当条件下,酶使亲核物质加入到切割的肽底物上以产生酰基化的转肽产物。可以确信,亲核物质与酰基-酶中间体的羧基结合并从酰基-酶中间体将酶替换下来。以这种方式,使亲核物质与肽底物的羧基基团连接。或者,酰基-酶中间体可能通过水脱酰基以产生水解产物。本发明的修饰的羧肽酶设计为优先产生多于水解产物的酰基化转肽产物。
图解I,如下所示,是羧肽酸催化的转酰***基反应的图示,其中E代表游离酶;S代表底物;ES为酶底物复合物;EAP代表有结合的离去基团的酰基-酶中间体,其中A是酰基成分,P是离去基团;EA是酰基酶;N代表亲核物质;并且AN代表所需的氨解产物。
图解I
如图解I中所示的,水解可以在转酰***基作用中的两个阶段发生。酰基-酶中间体可以被水解,从酶上释放出酰基成分和离去基团,而没有所需的氨解产物产生。目前认为水解主要发生在转酰***基反应中的这一点上。或者,酰基-酶可能在离去基团从酰基-酶中间体上解离后水解。修饰的羧肽酶本发明的修饰羧肽酶设计为与天然的丝氨酸或半胱氨基羧肽酶相比改善或增强肽底物的转酰***基作用。对天然羧肽酶修饰的基础是在肽底物和酶的活性位点之间提供“最佳匹配”。进行修饰时考虑的因素包括减少空间阻碍和减少水接近酰基-酶中间体的机会。
具体地,修饰的羧肽酶设计为通过用具有带负电侧链的氨基酸替换S1亚位点的氨基酸残基来改善或增强含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物的转酰***基作用。除了在P1位带正电残基,为增强在P3位含有带正电氨基酸的肽底物的转酰***基作用,可进行第二次替换,其中在S3亚位点或另一能与肽底物
P3残基相互作用的亚位点内的残基用具有带负电侧链的氨基酸残基替换。对于在P2位具有丙氨酸残基的肽底物,羧肽酶S2亚位点内的残基可以用具有疏水侧链的氨基酸残基替换。具体地,修饰的羧肽酶可用于改善生长激素释放因子(GRF)前体或胰高血糖样肽(GLP)前体的转酰***基作用。GRF(1-44),GLP1(1-36)-Xaa和GLP(7-36)-Xaa的序列如下所示,其中Xaa是作用为离去基团的C-末端氨基酸残基。Xaa残基通常具有不带电的氨基酸侧链,并且优选地是丙氨酸残基。GRF(1-43)-Xaa[SEQIDNO1]Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-XaaGLP1(1-36)-Xaa[SEQIDNO2]His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-XaaGLP1(7-36)-Xaa[SEQIDNO3]His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa为制备本发明的修饰的羧肽酶,可进行点特异诱变以替换天然羧肽酶活性位点中的氨基酸残基。具体地,可进行点特异诱变以用带负电氨基酸残基替换S1亚位点内的氨基酸残基。为进一步增强修饰的羧肽酶的转酰***基活性,可在
S2,S3或S1’亚位点内对氨基酸残基进行其它替换。并且,转酰***。S1亚位点内的替换羧肽酶的S1亚位点与肽底物的C末端次末位残基相互作用。通常,S1亚位点在决定羧肽酶的底物特异性方面起重要作用。这对于羧肽酶Y尤其正确。
本发明的第一方面涉及对含有带正电次末位氨基酸残基的肽底物进行转酰***基作用的方法。根据本发明,在羧肽酰的S1亚位点内引入具有带负电侧链的氨基酸以制备对含有带正电P1残基的肽底物具有增强的转酰***基活性的羧肽酶。
术语“具有带负电侧链的氨基酸”用于本发明的上下文中时,包括L-氨基酸和氨基酸衍生物如氨基酸酯或氨基酸酰***。合适的具有带负电侧链的氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。
在一个实施方案中,在羧肽酶Y的S1亚位点内的N241、L245、L178或W312位的至少一个位置引入具有带负电侧链的氨基酸。更优选的替换的实施例包括N241D、N241E、L245D、L245E、L178D、L178E、W312D和W312E。
S1亚位点内用于增强转酰***基作用的其它替换包括L178A、L178S和W312L。在L178位用丙氨酸或丝氨酸替换亮氨酸或在312位用亮氨酸替换色氨酸,导致原有氨基酸残基替换为体积更小的残基或极性更强的残基。可以确信,体积更小的残基的引入可通过减少空间阻碍增强转酰***基作用。
S1结合位点的大小因此而扩大从而可改善含有相对长侧链的P1氨基酸残基如精氨酸或赖氨酸的肽的转酰***基作用。极性残基如丝氨酸也能为带电的P1残基提供更有利的环境。S1’亚位点内的替换本发明的修饰羧肽酶对特异肽底物的转酰***基作用可通过替换天然羧肽酶S1’亚位点中的氨基酸残基得到进一步增强。在转酰***基反应中,S1’亚位点与进入的亲核物质和肽底物的离去基团的相互作用。因为认为竞争性水解反应主要在离去基团仍与酶结合时发生。所以S1’亚位点内增加离去基团从酰基-酶中间体上解离的速率和/或降低离去基团仍结合酶时水的进入的替换将通过减少竞争性水解反应来增加氨解产物的比例。优选地,这些替换对亲核物质与肽底物的结合没有不利影响。
S1’亚位点内可能进行有效替换的位置包括T60、F64、L267、L272、S297和M398。这些残基限定了羧肽酶Y的S1’侧链结合口袋。其它适于替换的残基包括Y49、N51、E65和E145。这些残基在S1’亚位点内形成氢键网。下列突变的羧肽酶与野生型羧肽酶相比对于更大的,疏水的离去基团如亮氨酸残基表现出所得氨基产物比例的改善T60A、T60W、T60Y、T60D、M398G、M398A、M398V、M398I、M398L、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E。对于以下突变,观察到最显著的改善T60Y、