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专利名称:修饰的硫氧还蛋白的制作方法
技术领域:
本发明涉及能调控由体内的内源和/或外源因子导致的异常的细胞生长和/或细胞功能的硫氧还蛋白(称作“TRX”)修饰蛋白,和基本上最小化的肽,编码修饰的蛋白和基本上最小化的肽的DNA,包含该DNA的重组表达载体,以该DNA转化的DNA,生产修饰的TRX蛋白和基本上最小化的肽的方法,以及包含修饰的TRX蛋白和/或基本上最小化的肽的药物或药物组合物。
背景技术:
硫氧还蛋白是12kD的小的多功能蛋白,在其活性位点序列-Cys-Gly-Pro-Cys(“细胞激活的氧化还原调控”,;15351-369)中具有氧化还原活性的二硫键/二巯基。硫氧还蛋白自从大肠杆菌(Escherichiacoli)中作为重要的合成脱氧核糖核苷酸的酶,核糖核苷酸还原酶的氢供体而分离之后,其已经从各种原核的和真核的生物中分离和鉴定到。成年T细胞白血病衍生因子(ADF)已首先被本发明人鉴定为感染HTLV-1的T淋巴细胞产生的IL-2受体诱导因子,并且是人硫氧还蛋白。细胞内硫氧还蛋白对清除自由基和调控用于氧化还原的转录因子例如活化蛋白-1和核因子-κB(“AP-1转录活性受硫氧还蛋白和Ref-1
之间的直接联系而调控”1997;943633-3638)起着重要作用。此外,人硫氧还蛋白控制p38有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和凋亡信号调控激酶(ASK-1)的信号传导。
同时,我们已经报道硫氧还蛋白被释放到细胞外并作为细胞因子或趋化因子,但其作用机制还不知道。尚未有关细胞外TRX被内吞到细胞中和通过修饰TRX活性位点产生比野生型TRX高得多的细胞内吞活性的报道。
本发明分析TRX的细胞内调控活性和细胞内吞活性,并打算提供基于活性的修饰的TRX和生产修饰的TRX的方法。
附图简述
图1显示实施例2的流式细胞分析的结果。
图2显示实施例2的流式细胞分析的结果。
图3显示实施例2的Western印迹的结果。
图4显示实施例3的凋亡分析的结果。
图5显示使用闪烁计数器测量3H-胸腺嘧啶吸收量的结果。
图6显示实施例4中增强效果-1对抗癌剂作用的结果。在图6中,CDDP(-)和CDDP(+)分别表示3μg/mL顺铂不存在或存在。TRX-WT,TRX-CS和TRX-C35S分别表示野生型硫氧还蛋白,两个位置C32S和C35S修饰的硫氧还蛋白,和C35S修饰的硫氧还蛋白。在CDDP(-),TRX-C35S中死亡的细胞与4%(TRX-WT),和3%(TRX-CS)增加大约4倍。在CDDP(+)(3μg/mL),TRX-C35S中死亡的细胞(26%)与5%
(TRX-WT)或13%(TRX-CS)比较增加大约5或2倍。
图7显示实施例4中增强效果-2对抗癌剂作用的结果。在图7中,CDDP,rec(-)和rec(+)分别表示顺铂,重组硫氧还蛋白(C35S-TRX)不存在或存在。右上象限代表双阳性,其是表示细胞死亡的区域(具有抗癌效果的区域)。例如,当用C35S-TRX处理1小时后,在存在10μg/mLC35S-TRX的CDDP(3μg/mL)的情况下双阳性细胞从10%提高2倍到22%。在CDDP(6μg/mL)中,双阳性细胞从18%提高4倍到76%。此外,当用C35S-TRX处理1小时后,在存在10μg/mLC35S-TRX的CDDP(3μg/mL)的情况下双阳性细胞从7%%。在CDDP(6μg/mL),双阳性细胞从23%提高3倍到70%。
发明内容
本发明人详细分析TRX的细胞内调控活性和细胞内吞活性,并最后成功鉴定细胞外的人重组野生型TRX的内吞活性。此外,他们成功制备了基于活性的修饰的TRX。就是说,(a)具有SEQIDNO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽;(b)具有SEQIDNO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被化学修饰的氨基酸序列的多肽;(c)具有SEQIDNO2氨基酸序列中除32和35位之外,优选SEQIDNO2氨基酸序列中除32到35位之外的位置存在一个或多个取代,缺失,插入或添加的氨基酸的氨基酸序列,并具有诱导凋亡活性的多肽;和
(d)由编码在SEQIDNO2氨基酸序列中半胱氨酸被其他的氨基酸取代的修饰的人氧还蛋白的DNA或能够与其互补链在严格条件下杂交的DNA编码的多肽。
,其中所述另外的氨基酸残基是丝氨酸。
(1)编码多肽的多核苷酸,或该多核苷酸的互补链,该多肽具有在氨基酸SEQIDNO2氨基酸序列中35位半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代,并此外在SEQIDNO2氨基酸序列中除32和35位以外,优选除32到35位以外的位置存在一种或者多种取代,缺失,插入或增加的氨基酸的氨基酸序列,并具有诱导细胞凋亡活性;和(2)编码在SEQIDNO2氨基酸序列35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的人修饰硫氧还蛋白的DNA,或能够与上述DNA的互补链在严格条件下杂交并编码具有细胞凋亡活性的多肽的DNA。
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,所述方法包括培养第5项的转化子。
,包括-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列。
-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽在用于生物活性物质的细胞内吞。
,该方法包括将生物活性物质结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
,其中生物活性物质结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
,其中包含由-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽是具有SEQIDNO2氨基酸序列的35位半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代的氨基酸序列的多肽。
,其中上述生物活性物质是蛋白或多肽。
,该方法包括培养转化有重组载体的转化子,该重组载体具有编码复合物的多肽,复合物中生物活性多肽已经结合到包含由-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸)代表的氨基酸序列的多肽。
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,该方法包括给药第1或2项的修饰的硫氧还蛋白,如果需要,与另外的抗癌剂一起给药到患癌症的病人。
,和如果需要,包括药物可接受的载体,赋形剂或稀释剂的药物或药物组合物。
本发明将在下文中更详细描述。
人硫氧还蛋白(hTRX)这里表示包含SEQIDNO2代表的105个氨基酸的多肽。
本发明的hTRX属于硫氧还蛋白超家族,和作为示例的是那些在其活性中心具有-Cys-Gly-Pro-Cys-,-Cys-Pro-Tyr-Cys-,-Cys-Pro-His-Cys-,或-Cys-Pro-Pro-Cys-的多肽。其中,活性中心具有
-Cys-Gly-Pro-Cys-序列的硫氧还蛋白是优选的。
在本发明的第一个实施方案中,已经发现通过将35位的半胱氨酸转化为另外的氨基酸制备修饰的TRX而表达诱导凋亡活性和抑制细胞生长活性,修饰的TRX有效用作抗癌剂。
本发明的第二个实施方案基于以下的发现,即通过或是将半胱氨酸残基转化为另外的氨基酸以进行修饰或化学修饰半胱氨酸残基(具体是巯基残基)以制备修饰的TRX使得修饰的TRX的细胞内吞急剧增加,并且第一次显示促进细胞内吞效应的实体基于由-Cys-Gly-Pro-A,-Cys-Pro-Tyr-A-,-Cys-Pro-His-A-或-Cys-Pro-Pro-A-(A代表除Cys以外的任何氨基酸或化学修饰的半胱氨酸)代表的氨基酸序列。
TRX的上述活性位点C端35位的Cys可以用19个氨基酸(Gly,Ala,Met,Ser,The,Lys,Arg,His,Val,Leu,Ile,Phe,Tyr,Trp,Pro,Gly,Asp,Gln,Asn)任一取代,并优选用Ser取代。
化学修饰的半胱氨酸包括那些半胱氨酸的巯基(SH)基团被SR(R是任意有机基团,其包括,例如,具有1-18碳原子的直链或支链烷基,具有2-18碳原子的直链或支链烯基,具有2-18碳原子的直链或支链炔基,具有2-18碳原子的直链或支链烷氧基烷基,具有1-18碳原子的直链或支链羟烷基,具有1-18碳原子的酰基,具有6-18碳原子的芳基,具有7-18
碳原子的芳烷基等,这些基团可以用取代基例如卤原子,羟基,硝基,氨基,单烷基氨基,二烷基氨基,甲氧基,羧基或酯基团取代)代表的基团取代的化学修饰。这样化学修饰的TRX可以使用公知的方法容易地合成。
本发明优选的修饰的硫氧还蛋白和编码修饰的硫氧还蛋白的基因显示于SEQIDNO11。
已经发现本发明修饰的硫氧还蛋白表达诱导凋亡活性和抑制细胞生长活性,并有效用作抗癌剂。
此外,本发明修饰的硫氧还蛋白能通过与其他的抗癌剂组合而增强抗癌效果。具体地,修饰的硫氧还蛋白通过以小于抗癌有效量的浓度与抗癌剂组合而诱导抗癌效果,增强抗癌剂的效果,并降低副作用。
效果被上述组合增强的抗癌剂包括阿霉素,甲氨蝶呤,紫杉酚,5-***脲嘧啶,长春碱,长春新碱,丝裂霉素,顺铂,道诺霉素,依托泊甙,泰索帝等。
本发明修饰的硫氧还蛋白和抗癌剂可以同时给药或可以分开给药。
本发明一个优选的实施方案涉及治疗癌症的方法,其中给药修饰的硫氧还蛋白和抗癌剂。
能够被治疗的癌症不是具体限定的,包括胃癌,结肠癌,直肠癌,肝癌,胆囊/胆管癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,膀胱癌,宫颈癌等。
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在本发明一个优选的实施方案中,本发明修饰的硫氧还蛋白可以基于SEQIDNO2的人硫氧还蛋白通过公知的基因工程技术而制备。所述修饰的蛋白在SEQIDNO2氨基酸序列中除32和35位之外,优选除32到35位之外的位置,具有一个或多个取代,缺失,添加或插入的氨基酸,并具有诱导凋亡活性。这样的突变(取代,缺失,添加和插入)包括人工的突变和天然发生的突变(如,等位基因)。产生人工突变的方法可以包括,但不限于,定点突变(,6487-6500,1982)等。只要不丢失诱导凋亡活性,突变的氨基酸的数目不受限制,但优选在20个氨基酸,更优选在15个氨基酸,再优选在10个氨基酸和最优选再5个氨基酸范围内。
在本发明另一个优选的实施方案中,包括编码修饰的人硫氧还蛋白的DNA,该蛋白在SEQIDNO2氨基酸序列中35位的半胱氨酸残基被另外的氨基酸取代,或能够与其互补链在严格条件下杂交并编码具有诱导凋亡活性的多肽的DNA,以及DNA编码的蛋白具有诱导凋亡活性。
“严格条件”这里指只发生特异性杂交而没有非特异性杂交的条件。这样的条件通常是等同于大约“1×%SDS
在37℃”的条件,优选大约“×%SDS在42℃”,和更优选“×%SDS在65℃”。本发明的DNA通常与编码35位被突变的本发明多肽的DNA(如,SEQIDNO11描述的DNA)具有高同源性。高同源性指同源性为75%或更多,优选90%或更多,更优选95%或更多和特别是99%或更多。
本发明的蛋白可以通过将后面所述的本发明的基因掺入到表达载体中并在合适的宿主细胞中表达而获得。作为载体,有可能合适地选择并使用那些公知的载体,例如pTrc-HisA等。宿主细胞包括真核细胞如哺乳动物细胞和酵母细胞,以及原核细胞如大肠杆菌(Escherichiacoli),枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),藻类和真菌的细胞,可以使用其中任意的成员。
无需受理论的限制,相信修饰的TRX表达诱导凋亡活性或抑制细胞生长活性,因为当35位Cys被另外的氨基酸例如Ser取代后,修饰的TRX作为TRX的拮抗剂起作用。
此外,据信在35位Cys被另外的氨基酸例如Ser取代的修饰的TRX以32位Cys结合到细胞表面,由于在35位没有Cys而在35位不结合到细胞表面,结果修饰的TRX被迅速内吞到细胞中。该机制还得到以下事实的支持,即所有Ser32修饰的TRX(35位Cys;SEQIDNO14),Ser32Ser35修饰的TRX(SEQIDNO13)和野生型TRX(32和35位Cys;SEQIDNO2)