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专利名称:促红细胞生成素类似物组合物和方法
技术领域:
本发明涉及人促红细胞生成素的类似物,它是一种已知可用于诱导红细胞生成和治疗因红细胞或网状细胞数量低所引起的疾病(如贫血)的糖蛋白。本发明还涉及制备所述类似物的方法和组合物以及用所述类似物诱导红细胞生成并治疗因红细胞或网状细胞数不足而引起的疾病(如贫血)的方法。
本发明的背景促红细胞生成素是一种天然存在的糖蛋白激素,首次报告的分子量约为39,000道尔顿(.,-5564(1977))。成熟激素的长为166个氨基酸,带前导肽的激素“前原”形式为193个氨基酸长(,美国专利4,703,008)。根据其氨基酸序列计算,成熟激素的分子量为18,399道尔顿(.,Nature313806-810(1985);,Browneetal.,-702(1986))。
已鉴定了人尿促红细胞生成素的结构特征为des-Arg166形式,由特异性除去成熟蛋白质C末端的Arg残基而形成(.,-17163(1987)。Recny等人(同上文)认为,在人血浆中循环的促红细胞生成素的生理活化形式为des-Arg166形式。
人促红细胞生成素含三个N-连接的碳水化合物链
(.,-12076(1987);.,Biochemistry275646-5654(1988);和MTakeuchietal.,,-3663(1988))。在天然存在的尿促红细胞生成素和通过于培养的哺乳动物细胞中表达已转染至细胞并编码激素前原形式的克隆DNA而生产的激素两者中,促红细胞生成素的碳水化合物内含物相似。N-连接的糖基化位点位于氨基酸残基24,38和83。在氨基酸残基126,尿和重组促红细胞生成素还均含有一个O-连接的糖基化位点(.,上文;.,.,上文;.,Biotechnology667-71(1988))。促红细胞生成素的碳水化合物内含物是含有或不含N-乙酰乳糖***重复单位(.,上文)的复合岩藻糖基化(fucosylated)四触角型链,并占促红细胞生成素质量的大约40%。
人促红细胞生成素作为一种糖蛋白激素主要由成年人肾产生(,-47(1981))。在肾中产生促红细胞生成素的细胞稀少而且位于肾小管间质中肾实质的内皮层(.,Blood71524-528(1988),.,-623(1988))。结果,肾组织的破坏,如发生肾功能衰竭,就会导致促红细胞生成素的产生减少,进而随之红细胞数减少,并发生贫血。
尽管胎肝细胞体外可产生促红细胞生成素(.,Endocrinology118567-572(1986)),但在大多数晚期肾功能衰竭患者中,没有代偿性促红细胞生成素产生,而且只有在进行了成功的肾移植后,血清的促红细胞生成素水平才恢复正常(.,(1966))。
在大多数情况下,晚期红细胞生成是通过在一种组织中产生的一种糖基化激素-促红细胞生成素进行的。在具有高血细胞比容的人无肾患者中已报道了一种罕见的红细胞生成途径。已经表明在这类患者中分离的红细胞生成因子是人胰岛素样生长因子I或IGF-I(.,-773(1989).,-729)。毫无疑问,IGF-(-483(1983))描述的有体内和体外活性的牛红细胞向性因子的人对应物。已知IGF-1受体存在于人红细胞上,而且通过IGF-1和其特异性受体的相互作用,这些受体使得可以产生这种罕见的晚期促红细胞生成替代途径。(.,-1212(1986).,(1988))。然而,促红细胞生成素受体基因的核苷酸序列是已知的,而且与人IGF-I受体的核苷酸序列没有序列同源性(′Andreaetal.,Cell57277-285(1989)),这说明通过
IGF-I的红细胞生成替代途径与促红细胞生成素介导的晚期促红细胞生成途径没有关系。
尽管还不了解其它的晚期红细胞生成替代途径,但已描述了几种可加强促红细胞生成素作用的因子。虽然早期的红细胞生成除取决于促红细胞生成素外,还取决于猝发启动活性,但晚期红细胞生成不但依赖于促红细胞生成素,而且受睾***,雌激素,和类红细胞(erythroid)加强因子的影响(,,[AcademicPress,NewYork]pp37-52)。已知象IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素9这类因子有猝发形成活性。但还不清楚这些活性是否对红细胞生成有任何生理学作用(.,Blood671002-1006(1986);.,Science2301171-1173(1985);.,Blood752271-2275(1989))。最近,已表明一种称为“类红细胞分化因子”的因子能增强促红细胞生成素的体内和体外活性(.,-9056(1988);.,Nature330765-767(1987))。已证明这种因子与苯丙酸诺龙A(促滤泡素释放蛋白质)相同,并且受follistatin(一种苯丙酸诺龙A的特异性抑制剂)的抑制,但还未确定苯丙酸诺龙A的生理学作用(.,
-1556(1992))。因此,研究了近二十年后,还不清楚红细胞生成除红细胞生成素外,还由什么激素控制。
在找不到影响红细胞生成的任何其他激素的情况下,在文献中已报道进行了若干种尝试以探索促红细胞生成素的结构并且通过定点诱变显著改善促红细胞生成素的特征。编码促红细胞生成素之人基因的分子克隆表明其DNA序列编码193个氨基酸的前原激素和166个氨基酸的成熟激素。由于可得到编码该激素和其前体(即前原形式)的克隆DNA,从而提供了用分子生物学中的标准方法进行诱变的机会(参见美国专利4,703,008上文)。
已经表明,通过氨基酸取代和缺失而制备的第一个突变促红细胞生成素(即促红细胞生成素类似物)其活性降低或未得到提高。如在美国专利4,703,008中描述的,用Phe置换15、49和145位的Tyr残基,用His置换7位的Cys,用Asp取代2位的Pro,缺失残基2-6,缺失残基163-166和缺失残基27-55并未使生物学活性得到显著的提高。Cys7到His7的突变使生物学活性丧失。在Asp残基24、38或83有一个氨基酸取代的一系列突变促红细胞生成素严重降低了活性(在24位的取代)或在细胞内迅速降解并显然不能分泌(在残基38或183的取代)。除去Ser126的O-连接的糖基化位点使促红细胞生成素类似物迅速降解或不能分泌(.,
-17521(1988))。这些作者得出结论位于残基38、83和126的糖基化位点对于适当分泌是必需的,而且位于残基24和38的糖基化位点可能与成熟的促红细胞生成素的生物活性有关。
促红细胞生成素的糖基化对于体外生物活性是必需的这一观点与在体外生物检测中去糖基化的促红细胞生成素仍有全部活性的报道背道而驰(.,Endocrinology1162293-2299(1985);.,-702(1986);美国专利4,703,008;.,-411(1990);,etal.,-20439(1991))。用寡核苷酸定向诱变己构建了一组与Dube等人(上文)研究的那些物质相似的促红细胞生成素类似物,以研究糖基化位点在促红细胞生成素之生物合成和生物活性中的作用()。这些研究人员得出结论糖基化对于促红细胞生成素的正确生物合成和分泌是至关重要的,但并影响该分子的体外活性。然而,Yamaguchi等人研究的、涉及改变糖基化位点的所有突变促红细胞生成素在体内没有生物活性。
普遍接受这一观点促红细胞生成素的糖基化对于该激素的体内活性起着至关重要的作用(.,Nature185102-105(1060);,
-53(1968);,-917(1972);.,-1388(1974);-.,-462(1990);.,Endocrinology1162293-2299(1985).,-411(1990);美国专利4,703,008;.,-702(1986).,-20439(1991))。
据认为去糖基化的促红细胞生成素类似物在体内没有生物活性是由于去糖基化的激素从被处理动物的循环中迅速清除而造成的。通过直接比较糖基化和去糖基化促红细胞生成素的血浆半衰期而使这一观点得到支持(,Blood7390-99(1989),.,Blood7384-89(1989))。
促红细胞生成素糖基化位点的寡核苷酸定向诱变已有效地研究了糖基化作用的功能,但仍未能提供深入了解有关显著改善治疗用该激素之特征的有效策略。
已构建了涉及氨基酸残基15、24、49、76、78、83、143、145、160、161、162、163、164、165和166的一系列单氨基酸取代的缺失突变体。在这些突变体中,改变了促红细胞生成素的
C末端、糖基化位点和Try残基。已将所述突变体施用于动物,同时监测血红蛋白、血细胞比容和网状细胞水平(EP0409113)。尽管许多这类的突变体保持了体内生物活性,但与天然促红细胞生成素相比,没有一个能显著提高血红蛋白、血细胞比容或网状细胞(一种红细胞的直接前体)水平。
还构建了另一组突变体以研究残基99-119(第一功能区)和残基111-129(第二功能区)的功能(.,-230(1991))。第一功能区突变体被迅速降解并在体外生物检测中失活,而第二功能区突变体充其量不过保持了体外活性。与野生型人促红细胞生成素相比,这些突变体的体内生物活性没有提高。这些作者得出结论残基99-119在促红细胞生成素的结构中起了重要作用。
人促红细胞生成素含两个二硫键,一个连接7位和161位的Cys残基,第二个连接29位和33位的Cys(P.-.,-3121(1986))。用寡核苷酸定向诱变研究连接Cys29和33的二硫键在人促红细胞生成素中的作用。将位置33的Cys变成Pro残基,在该残基模拟鼠促红细胞生成素的结构。所得突变体大大降低了体外活性。活性的丧失非常严重以致作者得出结论残基29和33间的二硫键对于促红细胞生成素的功能是必需的(F.-KLin,MolecularandCellularAspectsofErythropietinandErythropiesis,--(1987))

在人促红细胞生成素54位Met残基的位点特异性寡核苷酸定向诱变得到一个分子,它保持了母本(野生型)分子的体内生物活性,同时由于对氧化作用不敏感而有利于促红细胞生成素的制备(Shoemaker,美国专利4,835,260)。
在数种科学文献和专利申请中已描述了大量的人促红细胞生成素基因的突变体。这些突变体覆盖了该分子的全长,产生了部分或完全的去糖基化分子,改变了该分子中二硫键的结构,而且试图提高该分子的治疗活性。所有这些改变促红细胞生成素的努力,没有一种能成功地生产出体内生物活性提高或治疗应用特性有其它改善的分子。
不能鉴定后期红细胞生成的天然替代途径,因而也就不能成功地生产出体内活性提高的促红细胞生成素类似物,这使得无法进一步了解如何可以生产出经改善的促红细胞生成素分子。
本发明综述现已发现,在人促红细胞生成素及其类似物139位用Cys取代Arg(包括其中33位的Cys用另一种氨基取代的那些)得到一种糖激素,它的体内红细胞生成活性和其治疗应用上的效力,如诱导红细胞生成和治疗贫血,有明显的改善。
另外,出乎意料地发现,通过在天然存在的野生型蛋白质的氨基酸序列中进行一种附加的、代偿性改变(在第二位置),可以将哺乳动物,特别是人促红细胞生成素的第一类似物
[由于在天然存在的野生型蛋白质氨基酸序列中的改变(在第一位置)而使其体外或体内生物活性明显降低甚至丧失]变成活性明显提高的第二类似物。在蛋白质的一级序列中,即使第二位置与第一位置相隔也能得到这种结果。确实已发现,所述第二类似物具有几乎相同或甚至大于野生型促红细胞生成素的体内或体外活性。在本文中,“相隔”指至少一个氨基酸位置,更好是至少约10个氨基酸位置,可能甚至多于100个氨基酸位置的间隔。很容易鉴别所述双突变体,其中,在一个位置上氨基酸的改变因另一相隔位置上的氨基酸改变而代偿或甚至克服了活性的降低。
还首次发现并公开了通过在哺乳动物细胞中表达编码类似物之前原形式(即在其氨基末端带有哺乳动物促红细胞生成素前导序列的类似物)的DNA序列,制备本发明之改进的促红细胞生成素类似物的方法和组合物。令人惊奇地是,当施用于贫血或非贫血哺乳动物时,本发明的大部分类似物实质上比天然促红细胞生成素在红细胞生成方面更具有活性,而且令人惊异的附加的且显著的优点是,以比天然促红细胞生成素低的施用频度就可达到预期的治疗效果。
本发明的哺乳动物(特制是人)促红细胞生成素的类似物保持了与相应的天然促红细胞生成素相似的免疫特征或体外生物活性,以致于通过天然糖激素所用的常规方法就可以很容易地测量并监测所述类似物在血液、培养基、药物制剂等中的浓度。附图的简要说明结合附图描述本发明,其中

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