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使用食品级乳酸菌生产和递送的胰高血糖素样肽(glp-1和glp-2)及其制备方法
本发明公开了一种可以口服的,用于治疗糖尿病和修复肠黏膜损伤的,表达胰高血糖素样肽及其类似肽(GLP-1或GLP-2)的食品级重组乳酸菌及其制备方法。其特征在于:胰高血糖素样肽及其类似肽(GLP-1或GLP-2)的单个编码基因,或者多个基因串联在一起,在诱导型或者组成型启动子的控制下,与信号肽、锚定子结合,组成完整的表达框(expression?cassette)。该表达框被插入到thyA缺失的乳酸菌突变株的染色体,或者质粒上,用于胰高血糖素样肽及其类似肽在乳酸菌细胞内、细胞外、或者细胞壁锚定表达。本发明所述的重组乳酸菌是食品级的,不含外源抗生素抗性基因,可以用于直接口服。
【专利说明】使用食品级乳酸菌生产和递送的胰高血糖素样肽(GLP-1和GLP-2)及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于治疗糖尿病和修复肠黏膜损伤的,表达胰高血糖素样肽及其类似肽的食品级重组乳酸菌及其制备方法。更具体地说,本发明涉及制备食品级重组乳酸菌,用于表达和分泌胰高血糖素样肽I(glucagon-likepeptide,GLP-1)
、胰高血糖素样肽2(glucagon-likepeptide,GLP-2),以及它们的类似肽,用于口服治疗糖尿病、控制体重、促进肠黏膜的生长及损伤后修复。
技术背景
[0002]糖尿病,尤其是II型糖尿病及其并发症对人们的身心健康危害重大,已经成为现代流行疾病的第二杀手,仅次于癌症对人类的危害。注射胰岛素是目前治疗II型糖尿病的最有效方法,但注射胰岛素受剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响,处理不当很容易引起低血糖风险。同时,直接注射使用胰岛素还可以带来胰岛β细胞功能损害。因此,寻找更好的药物和治疗方法是人们致力攻克的一大难题。
[0003]胰高血糖素原(Proglucagon,PG)是含有160个氨基酸的单链前体蛋白,它具有组织特异性,在激素原转化酶(prohormoneconvertases,PCs)作用下进行翻译后加工,生成一系列具有不同生物活性的胰高血糖素原衍生肽(Proglucagon-derivedpeptides,PGDP)。本发明所涉及的两个多肽,胰高血糖素样肽-1和胰高血糖素样肽_2,即为两个具有重要生物活性的胰高血糖素原衍生肽。
[0004]胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素,是一种含37个氨基酸的多肽。GLP-1通过与胰岛β-细胞膜上的受体结合可以增加胰岛细胞腺苷酸环化酶的活性,刺激细胞内的第二信使
cAMP的增加,最终触发胰岛素的释放和分泌,促进胰岛β_细胞的增值、胰岛的再生,并且能够抑制肠胃排空,增加饱腹感从而减少饮食量。GLP-1是葡萄糖依赖性的,治疗糖尿病时不会出现低血糖症状,避免了糖尿病治疗中常存在的产生低血糖症的危险,因此是一种十分理想的治疗II型糖尿病的候选药物。在实际应用中,由于GLP-1是多肽,不能口服给药是其一大缺憾。
[0005]胰高血糖素样肽-2是一种含33个氨基酸的多肽,主要是肠的产物。GLP-2的主要作用是刺激肠黏膜隐窝细胞的增殖并抑制其凋亡,促进肠黏膜的生长及损伤后的再生修复。GLP-2还可以抑制胃酸的分泌和胃的运动,增加肠道的血液供应,提高肠道的屏障功能,促进肠道对营养物质的吸收等。对因接受放疗和化疗而诱发的严重放射性肠炎出血的癌症患者、慢性炎症性肠病(Inflammatoryboweldisease,IBD),溃瘍性结肠炎(UC)和Crohn病(⑶)患者、接受肠道外营养的患者、患有短肠综合症(shortbowelsyndrome,SBS)等胃肠疾病的患者具有明显的治疗作用。同样,由于GLP-2是多肽,难以直接用于口服给药是制约其市场普及的一个重要因素。
[0006]专利CN101824388A和CN1865430公布了使用毕赤酵母表达和生产GLP-1的方法;专利CN102660491A和
CN1587385公布了使用大肠杆菌表达和生产GLP-1的方法;专利CN1861635公布了使用大肠杆菌表达和生产GLP-2的方法。使用酵母的大肠杆菌,通过基因工程手段表达和生产GLP-1和GLP-2是一种经济、高效的方法,但由于酵母和大肠杆菌都不是食品级微生物,所生产的GLP-1和GLP-2必须经过纯化后注射使用,不能直接用于口服。
[0007]近年来,随着乳酸菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富,以活体乳酸菌为递送载体的药物递送逐渐成为乳酸菌应用研究的一个热点。乳酸菌是一个十分良好的多肽类药物的递送载体,因为它是人体的益生菌,适应肠道环境,并可以定殖到小肠内壁的上皮细胞。然而到目前为止,还没有使用乳酸菌作为载体生产和递送可以直接用于口服的GLP-1或GLP-2的专利公布。
[0008]本发明提供了一种使用乳酸菌作为生产和递送载体的、可以直接用于口服的GLP-1或GLP-2,及其制备方法。
[0009]使用食品级乳酸菌生产和递送GLP-1或GLP-2具有如下优势:
[0010]-乳酸菌自身耐酸,可以顺利穿过胃液,到达肠道;
[0011]-所生产的GLP-1或GLP-2不需要纯化,可以直接随乳酸菌用于口服给药;
[0012]-成本低廉、易于大量生产;
[0013]-比其它制剂具有更长的储存期及更强的稳定性;
[0014]-GLP-1或GLP-2主要靶向于消化道黏膜,不像注射或静脉滴注给药的GLP-1或GLP-2那样全身分布,给非靶标器官带来副作用;
[0015]-乳酸菌在肠道定殖期间还可以持续分泌GLP-1或GLP-2,其分泌和释放是持续和缓和的,符合最天然的药物代谢动力学。
【发明内容】
[0016]本发明的目的是公布一种使用食品级乳酸菌作为生产和递送载体的,可以直接用于口服的GLP-1或GLP-2及其制备方法。
[0017]本发明所述的用于口服的胰高血糖素样肽,其特征在于:胰高血糖素样肽1、胰高血糖素样肽2、以及它们的类似物的编码基因,或者多个胰高血糖素样肽I基因串联在一起的基因族,或者多个膜闻血糖素样妝2基因串联在一起的基因族,在诱导型或者组成型启动子的控制下,与信号肽、锚定子结合,组成完整的表达框(expressioncassette)。该表达框被插入到乳酸菌的染色体,或者质粒上来表达和分泌。
[0018]本发明所述的用于口服的胰高血糖素样肽,其特征还在于,作为表达载体的乳酸菌菌株染色体上的thyA被敲除,制备成条件致死型突变株。该突变株在人体内可以存活,但在环境中会迅速死亡,从而避免了插入基因在环境中的扩散。本发明所涉及的携载了胰高血糖素样肽及其类似肽的表达框的重组
乳酸菌是食品级的,不含外源抗生素抗性基因,可以用于口服使用。本发明所述的用于口服的胰高血糖素样肽,其特征还在于,通过不同的表达元件,如启动子、信号肽和锚定子的组合使用,胰高血糖素样肽及其类似肽是被表达在乳酸菌细胞内、或者分泌到乳酸菌细胞外,或者展示在细胞壁表面。
[0019]本发明是通过下述技术方案予以实现的:
[0020]本发明的主要技术环节包括:
[0021]制备细胞内表达的胰高血糖素样肽:人工合成启动子(组成型或诱导型)序列、胰高血糖素样肽(GLP-1、或GLP-2、或其类似肽)编码序列,组成表达框;使用Cre/lox位点特异性重组系统将表达框整合到表达宿主乳酸菌菌株染色体的thyA基因位置,与thyA基因发生置换,并去除抗生素抗性基因。或者直接插入到表达质粒上,转化乳酸菌感受态细胞,制备重组乳酸菌。
[0022]制备细胞外分泌表达的胰高血糖素样肽:人工合成启动子(组成型或诱导型)序列、信号肽序列、胰高血糖素样肽(GLP-1、或GLP-2、或其类似肽)序列,组成表达框;使用Cre/lox位点特异性重组系统将表达框整合到表达宿主乳酸菌菌株染色体的thyA基因位置,与thyA基因发生置换,并去除抗生素抗性基因。或者直接插入到表达质粒上,转化乳酸菌感受态细胞,制备重组乳酸菌。
[0023]制备细胞壁锚定表达的胰高血糖素样肽:人工合成启动子(组成型或诱导型)序列、信号肽序列、胰高血糖素样肽(GLP-1、或GLP-2、或其类似肽)序列、锚定子序列,组成表达框;使用Cre/lox位点特异性重组系统将表达框整合到表达宿主乳酸菌菌株染色体的thyA基因位置,与thyA基因发生置换,并去除抗生素抗性基因。或者直接插入到表达质粒上,转化乳酸菌感受态细胞,制备重组乳酸菌。
[0024]本发明所述的乳酸菌是指卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)所包含的所有乳酸菌属所有菌株,即:嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius),以及乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubspecieslactis)等。
[0025]本发明所述的胰高血糖素样肽(GLP-1、或GLP-2、或其类似肽)序列,都根据乳酸菌的密码子使用偏好性对核苷酸序列进行了优化,以利于在乳酸菌细胞表达。
[0026]本发明所述的经过优化后的胰高血糖素样肽(GLP-1、或GLP-2、或其类似肽)序列,是通过市场上的核酸合成服务商进行基因合成而获得的。
[0027]本发明所述的组成型启动子,是一种乳杆菌rRNA启动子的类似序列。
[0028]本发明所述的诱导型启动子,是被食品级的诱导物或者物理条件诱导的,如Nisin,温度、酸碱度,等。
[0029]本发明所述的将表达框整合到表达宿主乳酸菌菌株的染色体上,并去除抗生素抗性基因,是通过Cre/lox位点特异性重组实现的。表达框整合到染色体后,可以随着细胞分裂而稳定遗传,不会因外部选择压力的失去而丢失。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实例,对本发明做进一步说明。本发明的保护范围并不限定于下列实例。
[0031]实施例1:胰高血糖素样肽及其类似肽编码基因密码子优化[0032]由于胰高血糖素样肽及其类似肽编码基因为真核基因,其密码子使用偏好与乳酸菌有别。为了使其能够顺利在乳酸菌细胞表达,需要对其核苷酸序列进行优化,去除稀有密码子。
[0033]I)胰高血糖素样肽UGLP-1,7_37aa)及其类似肽的编码基因经过优化后的核苷酸序列如下:
[0034]catgctgaaggtacttttactagtgatgttagtagttatctagaaggtcaagetgetcaa60
[0035]gaatttattgcttggctagttgatggtactggt93
[0036]其中第2个密码子(get)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0037]get,gcc,gca,gcg,agt,age,ggt,ggc,gga,ggg,gtt,gtc,gtg,act,acc,aca,acg,aaa,aag,att,ate,gat,gac
[0038]其中第20个密码子(caa)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0039]caa,cag,aaa,aag
[0040]其中第28个密码子(gat)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0041]gat,gac,aaa,aag
[0042]其中第30个密码子(act)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0043]act,acc,aca,acg,cgt,egg,cga,cgc
[0044]其中第31个密码子(ggt)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0045]ggt,ggc,gga,ggg,get,gcc,gca,gcg,cgt,egg,aaa,aag
[0046]2)胰高血糖素样肽2(GLP-2,l_33aa)及其类似肽的编码基因经过优化后的核苷酸序列如下:
[0047]catgctgatggttcattttcagatgaaatgaatactattctagataatctagctgctcgt60
[0048]gattttattaattggctaattcaaactaaaattactgat99
[0049]其中第2个密码子(get)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0050]get,gcc,gca,gcg,agt,age,ggt,ggc,gga,ggg,gtt,gtc,gtg,act,acc,aca,acg,aaa,aag,att,ate,gat,gac
[0051]其中第19个密码子(get)可以由下列密码子中的如何一个替换:
[0052]get,gcc,gca,gcg,tct,tea,tcg,act,acc,aca,acg,cct,cca,ccg,ggt,ggc,gga,ggg
[0053]实施例2:胰高血糖素样肽表达框的构建
[0054]胰高血糖素样肽在乳酸菌的表达与定位是通过多个表达调控元件的组合使用来实现的。这些表达调控元件包括启动子、信号肽序列、目标肽编码基因、锚定子序列、以及各个表达调控元件之间的连接序列。
[0055]I)本发明所述的组成型启动子,是乳杆菌rRNA启动子的类似序列。