文档介绍：该【使用非随机引物的cdna合成的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【55】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【使用非随机引物的cdna合成的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。使用非随机引物的cdna合成的制作方法
专利名称:使用非随机引物的cdna合成的制作方法
技术领域:
本发明涉及选择性扩增靶核酸分子的方法和用于引发靶核酸分子的扩增的寡核苷酸。
背景技术:
基因表达分析通常涉及起始核酸分子的扩增。可以分别或联合应用逆转录(RT),体外转录(IVT)或聚合酶链式反应(PCR),进行核酸分子的扩增。起始核酸分子可以是mRNA分子,其可以通过首先合成互补cDNA分子,然后合成与第一cDNA分子互补的第二cDNA分子,从而产生双链cDNA分子来扩增。通常用逆转录酶进行第一链cDNA的合成,通常用DNA聚合酶进行第二链cDNA的合成。通过使用RNA聚合酶,双链cDNA分子可用于产生互补的RNA分子,从而扩增最初的起始mRNA分子。RNA聚合酶需要启动子序列以指导RNA合成的起始。例如,互补的RNA分子可以用作模板来产生另外的互补DNA分子。可选地,例如双链cDNA分子可以通过PCR来扩增,扩增的PCR产物可以用作测序模板或者用于微阵列分析。核酸分子的扩增需要使用与起始材料中一个或多个靶核酸分子特异性杂交的寡核苷酸引物。每一寡核苷酸引物可以包括位于寡核苷酸的与靶核酸分子杂交的杂交部分的5’端的启动子序列。如果寡核苷酸的杂交部分太短,那么寡核苷酸将不能稳定地与靶核酸
分子杂交,由此引发和随后的扩增将不能进行。同样,如果寡核苷酸的杂交部分太短,那么寡核苷酸将不能与一个或少数靶核酸分子特异性杂交,而是与大量的靶核酸分子非特异性杂交。不同靶核酸分子的复杂混合物(例如RNA分子)的扩增,通常需要使用具有不同核酸序列的多种寡核苷酸的群体。寡核苷酸的成本随着寡核苷酸的长度增加。为了控制成本,优选制备不长于确保寡核苷酸与靶序列特异性杂交所需的最小长度的寡核苷酸引物。通常不希望扩增高表达的RNA(例如核糖体RNA)。例如,在分析血细胞基因表达的基因表达试验中,对大量拷贝的高丰度球蛋白mRNA或者核糖体RNA的扩增,可能会使稀有mRNA的水平的微小变化不明显。因此,需要一组寡核苷酸引物,其选择性地扩增核酸分子群内的期望的核酸分子(例如,选择性扩增在细胞中表达的、除最高表达的RNA以外的所有mRNA的寡核苷酸引物)。为了降低合成寡核苷酸的群体的成本,每个寡核苷酸的杂交部分应该不长于在确定条件下确保与期望的靶序列的特异性杂交所需的长度。发明概述在一个方面,本发明提供了在较大的非靶核酸分子群中,选择性扩增靶核酸分子群(例如,除了最高表达的RNA种类以外,在细胞类型中表达的所有RNA分子)的方法。本发明的该方面的方法均包括以下步骤(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群,从分离自哺乳动物受试者的样品中的
RNA模板分子群合成单链引物延伸产物群,其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分,其中RNA模板分子群包括靶核酸分子群和非靶核酸分子群;(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群,从步骤(a)的单链引物延伸产物群合成双链cDNA,其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸,包括由6,7或8个核苷酸组成的杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列,其中杂交部分选自具有6,7或8个核苷酸的长度,并且在确定的条件下不与合成的单链cDNA中的非靶核酸分子群杂交的所有可能的寡核苷酸。在一些实施方案中,第一寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括随机杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列。另一方面,本发明提供了在较大的非靶核酸分子群中,选择性扩增靶核酸分子群的方法。这方面,本发明的方法包括以下步骤(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群,从分离自哺乳动物受试者的含总RNA的样品合成单链cDNA,其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分,其中杂交部分为包含SEQIDNO:1-749的寡核苷酸群的成员;以及(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群,从步骤(a)合成的单链cDNA合成双链cDNA,其中第二寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸,包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分,其中杂交部分为包含SEQIDNO=750-1498的寡核苷酸群的成员。
另一方面,本发明提供了用于转录组特征谱分析的方法。这方面,本发明的方法包括(a)用逆转录酶和第一寡核苷酸引物群,从分离自受试者的样品中的RNA模板分子群中的靶核酸分子群合成单链引物延伸产物群,其中所述第一寡核苷酸引物群包含杂交部分和位于杂交部分5’端的第一PCR引物结合位点,(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群,从步骤(a)的单链引物延伸产物群合成双链cDNA,其中所述第二寡核苷酸引物群包含杂交部分和位于杂交部分5’端的第二PCR引物结合位点,以及(c)用结合第一PCR引物结合位点的第一PCR引物和结合第二PCR引物结合位点的第二PCR引物,对步骤(b)产生的双链cDNA进行PCR扩增,其中非靶核酸分子群基本上由与哺乳动物受试者相同物种的核糖体RNA和线粒体核糖体RNA组成。另一方面,本发明提供了包含SEQIDNO:1-749的寡核苷酸群。例如,这些寡核苷酸可用于引发与分离自哺乳动物受试者的RNA分子互补的第一链cDNA分子的合成,而不引发与核糖体RNA(18SJ8S)或线粒体核糖体RNA(12S,16S)分子互补的第一链cDNA分子的合成。在某些实施方案中,寡核苷酸群中的每一寡核苷酸进一步包括位于杂交部分5’端的确定序列部分。在一个实施方案中,确定序列部分包括转录启动子,其在PCR扩增中用作引物结合位点或用于体外转录。在另一实施方案中,确定序列部分包括其不是转录启动子的
引物结合位点。例如,在一些实施方案中,本发明提供了寡核苷酸群,其中转录启动子例如T7启动子(SEQIDNO:1508),位于具有SEQIDNO:1-749中所示的序列的寡核苷酸群的成员的5'端。因此,在一些实施方案中,本发明提供了寡核苷酸群,其中每一寡核苷酸由位于具有SEQIDNO:1-749中所示序列的寡核苷酸群的不同成员的5'端的T7启动子(SEQIDNO1508)所组成。在进一步的实施方案中,本发明提供了寡核苷酸群,其中确定序列部分包括用于引发PCR合成反应但不包含RNA聚合酶启动子序列的至少一个引物结合位点。用于此类实施方案的确定序列部分的代表性实例为5'TCCGATCTCT3'(SEQIDNO:1499),其优选位于具有SEQIDNO:1-749所示序列的寡核苷酸群的成员的5'端。另一方面,本发明提供了包含SEQIDNO:750-1498的寡核苷酸群。例如,这些寡核苷酸可用于引发与从分离自哺乳动物受试者的RNA合成的第一链cDNA分子互补的第二链cDNA分子的合成,而不引发与逆转录自核糖体RNA(18S,28S)或线粒体核糖体RNA(12S,16S)分子的第一链cDNA互补的第二链cDNA分子的合成。在一些实施方案中,寡核苷酸群中的每一寡核苷酸进一步包括位于杂交部分5’端的确定序列部分。在一个实施方案中,确定序列部分包括转录启动子,其可在PCR扩增中用作引物结合位点或用于体外转录。在另一实施方案中,确定序列部分包括其不是转录启动子的引物结合位点。例如,在一些实施方
案中,本发明提供了寡核苷酸群,其中转录启动子例如T7启动子(SEQIDN0:1508),位于具有SEQIDNO:750-1498中所示序列的寡核苷酸群的成员的5'端。因此,在一些实施方案中,本发明提供了寡核苷酸群,其中每一寡核苷酸由位于具有SEQIDNO:750-1498中所示序列的寡核苷酸群的不同成员的5'端的T7启动子(SEQIDNO1508)所组成。在进一步的实施方案中,本发明提供了寡核苷酸群,其中确定序列部分包括用于引发PCR合成反应但不包含RNA聚合酶启动子序列的至少一个引物结合位点。用于此类实施方案的确定序列部分的代表性实例为5'TCCGATCTGA3'(SEQIDNO1500),其优选位于具有SEQIDNO=750-1498中所示序列的寡核苷酸群的成员的5'端。另一方面,本发明提供了在较大的非靶核酸分子群中,选择性扩增靶核酸分子群的试剂。在一个实施方案中,该试剂包括包含SEQIDNO:1-749的寡核苷酸的至少10%。在另一个实施方案中,该试剂包括包含SEQIDNO=750-1498的寡核苷酸的至少10%。另一方面,本发明提供了选择性扩增靶核酸分子群的试剂盒。这方面,本发明的试剂盒包括,包含用于第一链cDNA合成的第一寡核苷酸群的试剂,其中第一寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分,其中杂交部分为包含SEQIDNO:1-749的寡核苷酸群的成员。在一些实施方案中,试剂盒进一步包括用于第二链
cDNA合成的第二寡核苷酸群,其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括杂交部分和位于杂交部分5’端的确定序列部分,其中杂交部分为包含SEQIDNO:750-1498的寡核苷酸群的成员。另一方面,本发明提供了经选择性扩增的核酸分子的群,其包括哺乳动物受试者的转录组的代表,所述代表包含5’确定序列,相应于哺乳动物受试者中表达的核酸的经扩增的序列群,以及3’确定序列,其中经扩增的序列群对于特定哺乳动物物种而言特征在于具有下列性质(a)具有大于75%的多聚腺苷酸化和非多聚腺苷酸化转录本,并且具有少于10%的核糖体RNA。
通过参考下列详细描述并结合参考附图,本发明的上述方面及许多随之而来的优点将会更容易并且更好地被理解,其中附图IA显示了随机6-聚体(N6)寡核苷酸对人RefSeq转录本数据库中的核苷酸序列的精确匹配的数量,如实施例1中所描述的;图IB显示了不那么随机的(Not-So-Random,NSR)6-聚体寡核苷酸对人RefSeq转录本数据库中的核苷酸序列的精确匹配的数量,如实施例1中所描述的;图IC显示了使用用于第一链cDNA合成的随机引物的混合物和用于第二链cDNA合成的反-NSR6-聚体寡核苷酸的混合物,合成选择性扩增的cDNA分子的制备物的本发明方法的代表性实施方案,如实施例2所描述的;图ID显示了使用用于第一链cDNA
合成的NSR6_聚体寡核苷酸的混合物和用于第二链cDNA合成的反-NSR6-聚体寡核苷酸的混合物,然后PCR扩增,从而合成选择性扩增的aDNA分子的制备物的本发明方法的代表性实施方案,如实施例2和实施例4所描述
图2为举例说明受试者的全转录组分析的方法的流程图,其包括从分离自受试者的RNA选择性扩增核酸分子,之后对扩增的核酸分子进行序列分析或微阵列分析,如实施例4和实施例5所描述的;图3A为对数标尺上的柱形图,其显示了与使用随机引物(N8=100%)产生的第一链cDNA相比较,用不同NSR-6库合成的第一链cDNA分子群中18SJ8S,12Sn和16S(相对于基因和N8进行标准化)的相对丰度,如实施例3所描述的。图;3B图示了,与在第一链中使用NSR引物(SEQIDNO:1-749)然后在第二链中使用随机引物(N7)扩增的cDNA(NSR>N7=%18S,%28S)相比较,以及与在第一链中使用NSR引物(SEQIDNO:1-749)然后在第二链中使用反-NSR引物(SEQIDNO:750-1498)扩增的cDNA(NSR>反-NSR=%18S,%28S)相比较,在第一链和第二链合成中均使用随机引物(N7)扩增的cDNA中胞质沙嫩(185或观幻的相对丰度水平(N7>N7=100%18S,100%28S),如实施例3所描述的;图3C图示了,与在第一链中使用NSR引物(SEQIDNO:1-749)然后在第二链中使用随机引物(N7)扩增的cDNA(NSR>N7=27%12S,%16S)相比较,以及与在第一链中使用
NSR引物(SEQIDNO:1-749)然后在第二链中使用反-NSR引物(SEQIDNO:750-1498)扩增的。0嫩(赂1>反-赂1=%12S,%16S)相比较,在第一链和第二链合成中均使用随机引物(N7)扩增的cDNA中线粒体rRNA(12S或16S)的相对丰度水平(N7>N7=100%12S或16S),如实施例3所描述的;图4A为柱形图,其显示了在第一链合成期间用不同NSR引物合成的cDNA中,代表性基因转录本的基因特异性PolyA的含量,如实施例3所描述的;图4B为柱形图,其显示了在第一链cDNA合成期间用不同NSR引物,从Jurkat-1和Jurkat-2总RNA扩增的cDNA中,代表性非多聚腺苷酸化RNA的相对丰度水平,如实施例3所描述的;图5图示了,在用NSR-6聚体产生的cDNA中测量的Jurkat/K562mRNA表达数据的对数比值(χ-轴)对在用随机引物(N8)产生的cDNA中测量的Jurkat/K562mRNA表达数据的对数比值,如实施例3所描述的;图6A图示了在polyA纯化后所通常获得的总RNA中rRNA与mRNA的比例,其显示即使从总RNA中去除95%rRNA,剩余的RNA仍然由约50%rRNA和50%mRNA的混合物组成,如实施例3所描述的;图6B图示了在第一链cDNA合成期间用NSR引物且在第二链cDNA合成期间用反-NSR引物而制备的cDNA样品中rRNA与mRNA的比例。如图所示,与polyA纯化相比,用NSR引物和反-%rRNA,从而产生富集超过95%
的mRNA的cDNA群,如实施例3所描述的;图7A图示了跨越长转录本(彡4kb)的NSR引发的(虚线)或表达的序列标签(EST)(实线)cDNA中,polyA+RefSeqmRNA的检测和位置分布,其举例说明从5’端开始的每一碱基位置上显示的5,790个转录本的综合阅读频率,如实施例7所描述的;图7B图示了跨越长转录本(彡41Λ)的NSR引发的(虚线)或表达的序列标签(EST)(实线)cDNA中,polyA+RefSeqmRNA的检测和位置分布,其举例说明从3’端开始的每一碱基位置上显示的5,790个转录本的综合阅读频率,如实施例7所描述的;以及图8图示了相对于从分离自通用人类参照(UHR)细胞系的RNA产生的NSR-引发的cDNA,从分离自全脑的RNA产生的NSR-引发的cDNA中,由第15号染色体I^rader-Willi神经疾病基因座编码的小核RNA(SnoRNA)的丰富程度,如实施例7所描述的。发明详述除非本文明确定义,本文所用的所有术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。对于本领域的定义和术语,请技术人员特别关注Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborPress,Plainsview,NewYorkjPAusubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork,1999。用于第一链cDNA合成的不那么随机的(Not-So-Random,〃NSR“)6_聚体引物的使用描述于2006年10