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使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法.docx

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使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法.docx

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专利名称:使用重组大肠杆菌生产番茄红素的方法
技术领域:
本发明涉及利用细菌菌株生产高浓度番茄红素的方法,该菌株用含有参与番茄红素生物合成的蛋白的编码基因的载体进行转化。更详细来说,本发明涉及通过在特定条件下培养和发酵转化的大肠杆菌,生产率增加的番茄红素生产方法,该转化的大肠杆菌具有导入的载体,载体含有番茄红素生物合成所需的基因,其中载体通过合并下列新基因中的至少一个来制备序列表中核苷酸序列1的crtE,核苷酸序列3的crtB,和核苷酸序列5的crtl。
背景技术:
番茄红素具有化学结构1中显示的结构,。番茄红素造成了番茄、西瓜、葡萄等的红色,是极性非常低的脂溶性物质,并具有强抗氧化和抗癌效应。[化学结构1]下面是关于本技术领域现有研究的概述。在2000年,由底特律Carmanos癌症研究会(CarmanosCancerinstitute)的Omer的团队报道了番茄红素抑制前列腺癌的转移(OmerKucuk等,CancerEpidemiology,10,861-869,2001)。番茄红素的专业制造商LycoRed和特拉维夫(TelAviv)Hasharon医院(Hasharonhospital)的过敏实验室证实,番茄红素在患有运动引发的哮喘的患者中具有缓解症状的效应
(LNeuman等,Allergy,55,1184-1189)o根据芬兰Cuopio大学公共卫生研究所(ResearchInstituteofPublicHealthoftheUniversityofCuopio)进行的临床试验,番茄红素也显示出对于心肌病和动脉粥样硬化具有出色的防护效应(TiinaRissanen等,ExpBiolMed(Maywood).,227,900-907,2002)。由于类胡萝卜素的优越效应如以前所述得到了证明,因此对番茄红素的需求日益增长。番茄红素已经通过从天然来源直接提取或通过有机合成来生产,但是最近有研究积极地利用微生物对其进行生产。具体来说,有两种类型的方法涉及培养和发酵微生物来生产番茄红素(1)包括将番茄红素生物合成所需的基因导入不产生番茄红素的细菌菌株的方法,(2)包括将产生番茄红素作为生物合成类胡萝卜素例如胡萝卜素或虾青素的中间代谢产物的细菌菌株的番茄红素环化酶失活的方法。番茄红素生物合成的过程显示在
图1中。通过代谢途径例如2-C-***-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(在后文中称为MEP途径)或甲羟戊酸途径(在后文中称为MVA途径),葡萄糖或甘油被转化成异戊烯基焦磷酸(在后文中称为IPP)或二***烯丙基焦磷酸(在后文中称为DMAPP)。本发明采用了MVA
3途径来生物合成IPP。通过MVA途径,源自于葡萄糖或甘油的甘油醛-3-磷酸被转化成乙酰辅酶A(Acetyl-C0A),它然后经历一系列转化,成为乙酰乙酰辅酶
A、3-羟基-3-***戊二酰辅酶A(在后文中称为HMG-CoA)、甲羟戊酸、甲羟戊酸-5-磷酸、甲羟戊酸_5_二磷酸,并最终成为IPP。编码该过程所需的酶的基因是atoB、mvaS、mvaA、mvaKl、mvaK2和mvaD。这样合成的IPP经历了一系列转化,变成法呢基焦磷酸(在后文中称为FPP),它是类异戊二烯途径的重要中间代谢产物。然后FPP被转化成香叶基香叶基焦磷酸(在后文中称为GGPP),它然后转化成八氢番茄红素,然后最终转化成番茄红素。编码参与该过程的酶的基因是crtE、crtB禾口crtl。如上所述,作为类胡萝卜素共同前体的IPP的生物合成途径,已经知道有甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径,并且已知甲羟戊酸途径存在于大多数真核生物(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、植物细胞的细胞质、一些细菌(例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)禾口Paracoccuszeaxanthinifaciens)双细!&中°
羟戊酸途径存在于大多数细菌(例如大肠杆菌())、以及植物细胞的质体中。因此,革兰氏阴性细菌大肠杆菌只通过非甲羟戊酸途径生物合成IPP。但是,野生型大肠杆菌不具有类胡萝卜素例如番茄红素的生物合成所需的基因,因此不能生产番茄红素。关于从不产生番茄红素的菌株生产番茄红素,许多研究关注于发现参与番茄红素生物合成的新基因或重组目前已知的基因,焦点在于使用这些基因在大肠杆菌或酿酒酵母
中生物合成番茄红素。RocheVitamins,(Flavobacteriumsp.)R1534的crtB、crtI和crtE基因,(LuisPasamontes禾口YuriTsygankov,US20040058410,2004)。AmocoCorporation通过使用来自于草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)的crtl基因,(Ausich,,US5,530,189,1996)。KirinBeerKabushikiKaisha通过使用来自噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)的crtE、crtI和crtB基因,(NarihikoMisawa等,US5,429,939,1995)。还有成功制备和培养了产朊假丝酵母(Candidautilis)转化菌株IF00988,;它具有来自噬夏孢欧文氏菌的crtE、crtB和crtl基因,以及编码产朊假丝酵母的HMG-CoA还原酶的基因(NarihikoMisawa等,,59,169-181,1998)。最近,通过用从橙黄土壤杆菌(Agrobacteriumaurantiacum)、草生欧文氏菌和噬夏孢欧文氏菌的细菌菌株克隆的类胡萝卜素基因crtE(编码GGPP合酶)、crtB(编码八氢番茄红素合酶)和crtl(编码八氢番茄红素去饱和酶)进行转化,获得了重组大肠杆
菌菌株,已报道其具有生物合成番茄红素的能力(美国专利6706516;Misawa和Shimada,.,59:169_181,1998)。但是,这些研究的产量非常低,阻碍了开发用于生产番茄红素的经济的工艺。为了解决这个问题,本发明使用了新的基因以及基因组合,提供了使用转化微生物,以改善的生产率生产番茄红素的方法,其中将大肠杆菌用atoB、mvaS、mvaA、mvaKl、mvaK2和mvaD转化,它们是参与甲羟戊酸途径的酶的编码基因。因此,本发明是改进番茄红素生产率的努力的结果为此,从海水宏基因组分离并克隆了一些参与番茄红素生物合成的基因crtE、crtB和crtl,并测定了它们的核苷酸序列;然后将这些基因导入载体,以便在不产生番茄红素的微生物中生产番茄红素,同时通过将新的基因与当前已知基因进行组合,改善了番茄红素的生产率。此外,通过将参与甲羟戊酸途径的基因导入大肠杆菌,由此使大肠杆菌能够利用甲羟戊酸途径,进一步增加了番茄红素的生产率。此外还开发并提供了发酵方法,用于在特定条件下在重组微生物中生产高浓度番茄红素;已经证实菌株与现有研究相比生产率更高,于是本发明得以完成。
发明内容
技术难题相应地,本发明涉及从重组细菌菌株有效生产番茄红素的方法,该菌株使用含有编码番茄红素生物合成所需蛋白的新基因的重组载体来构建。按照本发明的一个方面,生产番茄红素的方法包括下列步骤制备含有番茄红素
生物合成所需蛋白的编码基因的重组载体,其中参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtl,三个基因(crtE、crtB和crtl)中的至少一个选自序列列表中核苷酸序列1的crtE、核苷酸序列3的crtB、和核苷酸序列5的crtl;将重组载体转化到大肠杆菌中;以及培养大肠杆菌转化体并从培养基中回收番茄红素。下面,将对本发明进行更详细的描述。本发明包括从海水宏基因组克隆crtE、crtB和crtl,它们是编码番茄红素生物合成所需蛋白的3个新基因;建立包含这些基因的重组载体;以及用重组载体转化不产生番茄红素的大肠杆菌。此外,通过对转化有含有至少一个新基因的重组载体的大肠杆菌进行发酵,证明了生产高浓度番茄红素的可能性;优选,新的crtB(序列3)和crtl(序列5)基因与目前已知的crtE基因的组合,被证明提供比现有研究更高的生产率;从而实现了本发明。本发明的新基因是从海水宏基因组获得的,它们各以核苷酸序列序列1、序列3或序列5编码番茄红素生物合成所需的蛋白。序列1、序列3和序列5分别编码下面的氨基酸序列序列2(GGPP合酶),序列4(八氢番茄红素合酶),序列6(八氢番茄红素去饱和酶)。本发明提供的基因可以转化到通常用于番茄红素生产的各种不同的宿主细胞中。每个新基因可以单独使用,或者它们中的两个以上一起使用。例如,可以将本发明的
crtl转化到只具有crtE和crtB的微生物中来生产番茄红素;此外,可以将本发明的crtE、crtB和crtl转化到生物合成类胡萝卜素例如虾青素的微生物中,以获得更好的产量。通过使用番茄红素生物合成基因以及参与甲羟戊酸途径的基因,本发明提供了在大肠杆菌中经甲羟戊酸途径生产番茄红素的方法。本发明的包括使用番茄红素生物合成基因在微生物中产生番茄红素的方法,包括下列3个步骤(1)制备重组载体,所述载体除了番茄红素生物合成所需蛋白的编码基因之外,还含有mvaKl、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi,其中参与番茄红素生物合成的基因是crtE、crtB和crtl,并且三个基因(crtE、crtB和crtl)中的至少一个选自下面的基因序列列表中核苷酸序列1的crtE,核苷酸序列3的crtB,和核苷酸序列5的crtl;(2)将重组载体转化到大肠杆菌中;(3)培养大肠杆菌转化体并从培养基中回收番茄红素。番爺红素生物合成所需的mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtl禾口idi基因,可用于构建至少一个或一个以上的独立的载体,其中每个载体含有选自这些基因中的至少一个基因;例如,每个mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtl禾口idi基因可以单独用于构建9个载体,或用于构建几个含有至少一个基因的载体,用于转化。但是,单独构建的载体的组合,其方式应该使转化的大肠杆菌具有所有的
mvaK、mvaD,mvaK2,mvaE,mvaS、crtE、crtB、crtl和idi基因。本公开的mvaE是在图2中所示的番茄红素生物合成过程中具有atoB和mvaA二者的功能的基因。优选,准备转化到大肠杆菌中的载体可以被分别构建,以便一个载体具有mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE禾口mvaS基因,另一个载体具有crtE、crtB、crtI禾口idi;其中,mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE和mvaS基因可以来自当前已知的基因,而crtE、crtB和crtl基因中的至少一个可以来自海水宏基因组。作为本发明的优选实践,含有crtE、crtB、crtI和idi基因的重组载体具有下列基因序列7的crtE基因,序列3的crtB基因,序列5的crtl基因和大肠杆菌的idi基因。作为本发明的另一个优选实践,含有crtE、crtB、crtl和idi基因的重组载体具有下列基因序列8的crtE基因,序列3的crtB基因,序列5的crtl基因和大肠杆菌的idi基因。作为本发明的另一个优选实践,含有crtE、crtB、crtl和idi基因的重组载体具有下列基因来自草生欧文氏菌的crtE基因,序列3的crtB基因,序列5的crtl基因和大肠杆菌的idi基因。本发明不限于通过构建某些类型的重组载体的基因组合,而是还包括构建具有mvaK、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtl禾口idi基因的大肠杆菌菌株的任可方法,其中crtE、crtB、crtl中的至少一个是从海水宏基因组获得的本发明的基因。更详细来说,为了从重组菌株的培养物生产高浓度番茄红素,基本的培养条件被
最适化如下培养温度为25-35°C,-,振荡速度在200rpm到1,OOOrpm之间,溶解氧的浓度在20%到30%之间。另一方面,为了提高细胞的生长和番茄红素的产量,适宜进行分批补料培养。当碳源耗尽时补充培养基;其中补料受到控制,%的培养基,培养基的成分是70%甘油和2%MgSO4·H2O0对于本发明来说,测量了按照方法转化的菌株产生的番茄红素的量具有本发明提供的新的crtE、;,,如果进行附加的IPTG诱导,。为了实现本发明的目标,详细描述如下引入甲羟戊酸途径;确定基因的最佳组合;通过对按照本发明制备的重组大肠杆菌进行发酵,对发酵条件进行最适化;以及建立比以前发明更高的生产率,提供了优于以前发明的优点。以前的发明提供高产量,但是需要很多时间,而本发明在短时间内提供高产量,使得开发经济的工艺成为可能。附图简述图1说明了番茄红素生物合成的过程。图2是重组载体pSANF的结构。图3是重组载体pT5_ErEBI的结构。图4是重组载体pT5-LYC_idi的结构。图5是重组载体
pT5_ErBI的结构。
图6是重组载体pT-EF5的结构。
图7是重组载体pT-RF5的结构。图8是重组载体pT-SF5的结构。实施发明的最佳方式
本发明根据下面的实施例进行了更详细的描述。然而,下面的实施例仅仅是为了说明本发明,本发明的范围不受下面的实施例的限制。实施例1野生型大肠杆菌不产生番茄红素,因此将参与甲羟戊酸、IPP和番茄红素生产的mvaKl、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS、crtE、crtB、crtl禾口idi基因导入,以生产番爺红素。一开始,这些基因被导入到如下两个载体中mvaKl、mvaD、mvaK2、mvaE和mvaS基因被导入PSTV28,而crtE、crtB、crtI和idi基因被导入pTrc99A。pSTV28具有***霉素抗性,pTrc99A具有氨苄青霉素抗性,因此可以使用这两种抗生素选择同时含有两种载体的重组菌株。在那些基因中,mvaKl、mvaD、mvaK2、mvaE、mvaS和idi基因来自其序列已经知道的基因,而crtB和crtl基因从海水宏基因组中筛选。来自宏基因组的crtE基因和来自以前已知基因的crtE基因被分别使用,以测量番茄红素的生产率。mvaKl基因从金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC35556克隆。将从金黄色葡萄球菌ATCC35556的基因组DNA扩增的DN***段用EcoRI和SacI消化,然后插入到在同样的限制性位点被消化的PSTV28载体中,得到的重组载体被命名为