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专利名称:使用遗传修饰的生物产生生物质降解酶的制作方法
使用遗传修饰的生物产生生物质降解酶
交叉参考本申请要求下列美国临时申请的优先权和权益Mayfield等人于2007年6月1日提交的标题为“使用光合生物产生生物燃料”的USSN60/941,452;Mayfield等人于2008年3月20日提交的标题为“使用遗传修饰的生物产生生物质降解酶”的USSN61/070,384;以及Mayfield等人于2008年3月20日提交的标题为“高通量筛选遗传修饰的光合生物”的USSN61/070,437。这些在先申请中的每一个通过引用并入本文。
参考并入本说明书提及的所有公开和专利申请通过引用并入本文,其程度如同每个单独的公开或专利申请被具体并单独地指出通过引用并入。
背景技术:
燃料变得越来越昂贵。同时,燃料精制与污染物的产生和全球温室效应相关。在工业中存在寻找更廉价、更安全以及对环境更加无害的方式产生燃料的日益增加的需要。从生物原料产生燃料的方法的开发是未来能源蓝图的主要部分。从生物原料生产燃料的最重要的因素之一是将某些分子结构例如纤维素消化或还原为可公认为用于燃料产生方法例如发酵的底物的分子种类的能力。分子生物学和基因工程有希望用于大量生物活性分子的生产,所述生物活性分子
可用于产生这些燃料。例如,生产能够将有机原料分解为燃料的酶有希望解决对可选的燃料增加的需要。使用基因工程技术用于产生这些酶的主要优势是该方法能够产生大量所期望的蛋白。在许多情况下,从非工程化分泌来源获得足量生物原料的仅有的其它方法是通过从产生该试剂的生物的细胞纯化自然发生的生物原料。因此,在基因工程到来之前,能够降解有机原料的酶只能通过大量培养生物,通常为细菌或真菌物种并提取蛋白来分离。对于用于燃料生产,这些方法通常是复杂的并且经济上受限制的。虽然基因工程提供方法以产生大量生物原料,特别是蛋白和核酸,但是对目前可用的方法有局限性。细菌提供适合于产生这种酶的环境;但是,一些细菌产生的副产品会污染燃料源。因此,即使细菌可用于产生生物原料,可能需要另外的步骤例如纯化或精制以获得生物活性原料和/或生物燃料。而且,非光合系统的使用需要添加昂贵的糖类或其它有机碳源以饲养重组生物。另外,通常存在与建造发酵罐相关的大量的资金投资。重组蛋白还可在真核细胞中产生,包括例如,真菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞,其可提供必要的环境将表达的蛋白加工为生物活性剂。但是,这些系统通常要承受同样的成本限制(糖类/有机碳源和发酵罐)。因此,存在这样方法的需要以方便地产生具有生物活
性的酶,该方法可产生大量酶和/或提供与产生降解酶相容的宿主生物。
发明概述本文提供的是用于产生生物质降解酶和生物燃料的组合物和方法。本文公开的发明提供用于产生生物质降解酶的新的方法,其通常在遗传修饰的光合生物例如藻类和蓝细菌中。本文还提供的是用于转化光合生物的组合物和方法以及筛选转化子的方法。因此,本发明的一方面提供载体,其包括编码生物质降解酶的核酸和设置用于在非维管光合生物中表达核酸的启动子。本发明的载体可含有编码多于一种的生物质降解酶的核酸,以及在其它情况下,可含有编码共价连接生物质降解酶的多肽的核酸。生物质降解酶可包括分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶和分解木质素的酶。更具体地,生物质降解酶可以是外切_0_葡聚糖酶、内切_0_葡聚糖酶、0“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。编码生物质降解酶的核酸可源自真菌或细菌来源,例如,那些编码绿色木霉(Trichodermaviride)中外切葡聚糖酶、里氏木霉(Trichodermareesei)中外切葡聚糖酶、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)中外切-0-葡聚糖酶、里氏木霉中内切-0-葡聚糖酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中内切-0-葡聚糖酶、里氏木霉中葡糖苷酶、黑曲霉中葡糖苷酶、里氏木霉中内切木聚糖酶和黑曲霉中内切木聚糖酶的核酸。其它编码生物质降解酶的核酸可以是与来自这些生物的基因同源。本发明的载
体还可含有选择标记,使得能够直接筛选转化的生物。本发明的载体可以能够在多种光合生物中稳定转化,这些光合生物包括但不限于光合细菌(包括蓝细菌(cyanobacteria))(cyanophyta)(prochlorophyta)(rhodophyta)
藻(chlorophyta)、不等If更毛藻(heterokontophyta)、tribophyta、灰@藻(glaucophyta)>chlorarachniophytes、丰果藻(euglenophyta)、类目艮虫(euglenoids)、If更藻(haptophyta)>金藻(chrysophyta)、疼急藻(cryptophyta)、疼急滴虫(cryptomonads)、甲藻(dinophyta)、双I■(dinoflagellata)>Ifl^(pyrmnesiophyta)>r±^(bacillariophyta)>jt^(xanthophyta)>eustigmatophyta>(raphidophyta)(phaeophyta)禾口胃
物(phytoplankton)。本发明的其它载体能够在莱茵衣藻()、盐生杜氏藻()或雨生红球藻()中稳定转化。还有其它载体含有倾向于生物(例如,莱茵衣藻)的密码子偏好的核酸。本发明的具体载体含有本文提供的序列(,,,,,,、)。还提供包括本发明载体的宿主细胞。在一些情况下,宿主细胞是非维管光合生物,
例如,分类为光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻、原绿藻、红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、类眼虫、鞭藻、金藻、隐藻、隐滴虫、甲藻、双鞭藻、定鞭藻、硅藻、黄藻、eustigmatophyta、针胞藻、褐藻和浮游植物的生物。本发明的宿主细胞也可以是微观藻类物种,包括但不限于莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻。在其它情况下,宿主细胞可以是多细胞光合生物的一种或多种细胞。对于一些实施方式,宿主细胞可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还提供组合物,其含有一种或多种外源生物质降解酶,所述降解酶源自一种或多种非维管光合生物。在一些情况下,这些组合物还可含有非维管光合生物的元件。酶与生物元件的比值(W/V)可以是至少110,或经发现元件可仅以痕量存在。组合物中的一些包括至少一种下列酶外切_0_葡聚糖酶、内切_0_葡聚糖酶、0“葡糖苷酶、内切木聚糖酶和/或木质酶;其中酶或多种酶从一种或多种下列生物分离莱茵衣藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻、光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻、原绿藻、红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、类眼虫、鞭藻、金藻、隐藻、隐滴虫、甲藻、双鞭藻、定鞭藻、硅藻、黄藻、eustigmatophyta、针胞藻、褐藻和浮游植物。对于一些实施方式,生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还提供含有多个载体的组合物,其中每个载体编码不同的生物质降解酶和
在叶绿体中用于表达生物质降解酶的启动子。这些组合物可含有编码具体酶的具体载体的多个拷贝。在一些情况下,载体将含有编码分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶和/或分解木质素的酶的核酸。更具体地,所述多个载体可含有能够表达外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶和/或木质酶的载体。该实施方式的一些载体能够插入至叶绿体基因组,这些插入可导致破坏转化的叶绿体的光合能力。其它载体插入至叶绿体基因组并不破坏转化的叶绿体的光合能力。一些载体提供用于表达生物质降解酶,其被隔离在转化的叶绿体中。还有其它载体可含有本文提供的特定序列(、、、、、、)。本发明还提供含有如上所述的载体组合物的藻类细胞,并具体地提供含有载体组合物的莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻细胞。对于一些实施方式,细胞可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明的另一个载体编码多个不同的生物质降解酶和在非维管光合生物中用于表达生物质降解酶的启动子。生物质降解酶可以是一种或多种分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶。在一些载体中,多个不同的生物质降解酶是外切
-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木质酶和内切木聚糖酶中的两种或更多种。在一些实施方式中,多个酶是可操作连接的。在其它实施方式中,多个酶是作为一个功能蛋白复合体表达。一些载体插入至宿主细胞基因组并不破坏生物的光合能力。编码多个不同的酶的载体可引起酶的产生,其被隔离在转化的生物的叶绿体中。本发明还提供用编码多个不同的酶的载体转化的藻类细胞或蓝细菌细胞。在一些情况下,藻类细胞是莱茵衣藻、盐生杜氏藻或雨生红球藻。在其它情况下,蓝细菌细胞是集胞藻属(Synechocystis)或聚球菌属(Synechococcus)或螺旋藻属(Athrospira)的种。对于一些实施方式,生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还另一方面提供产生一种或多种生物质降解酶的遗传修饰的叶绿体。这些酶可以是分解纤维素的、分解半纤维素的或分解木质素的酶,更具体地,可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶、木质酶和/或其组合。在一些实施方式中,一种或多种酶被隔离在叶绿体中。本发明还提供含有本发明的遗传修饰的叶绿体的光合生物。还另一方面提供用于制备生物质降解酶的方法。该方法包括步骤(1)转化光合、非维管生物以产生所述生物质降解酶或增加所述生物质降解酶的产生以及(2)从所述转化的生物收集生物质降解酶。转化可以用组合物进行,所述组合物含有编码不同生物质降
解酶的多个不同载体。转化还可用编码多个不同的生物质降解酶的载体进行。任何或所有酶可以是可操作互相连接的。在一些情况下,叶绿体被转化。本发明的该方法可具有一种或多种另外的步骤,其包括(a)收获转化的生物;(b)干燥转化的生物;(c)从细胞培养基收获酶;(d)机械破坏转化的生物;或(e)化学破坏转化的生物。该方法还可包括进一步通过高效液体色谱纯化酶。在一些情况下,转化的生物是藻类或光合细菌,例如蓝细菌。对于一些实施方式,生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。本发明还另一个方法能够制备生物燃料。该方法的一个步骤包括用源自光合非维管生物的一种或多种生物质降解酶处理生物质一段足够的时间以降解至少一部分所述生物质。产生的生物燃料可以是乙醇。该方法的酶可含有至少痕量的所述光合非维管生物,所述酶源于所述光合非维管生物。另外,用于该方法一些实施方式的酶包括分解纤维素的、分解半纤维素的和分解木质素的酶。用于该方法一些方面的特定酶包括外切_葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶和/或木质酶。该方法的生物可包括光合细菌(包括蓝细菌)、蓝藻、原绿藻、红藻、绿藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、类眼虫、鞭藻、金藻、隐藻、隐滴虫、甲藻、双鞭藻、定鞭藻、硅藻、黄藻、eustigmatophyta、针胞藻、褐藻和浮游植物。用于该方法的其它生物是微观藻
类,包括但不限于莱茵衣藻、盐生杜氏藻和雨生红球藻。对于一些实施方式,生物可以在缺乏光照下生长和/或在有机碳源存在下生长。多种类型的生物质——包括农业废弃物、造纸厂废弃物、玉米秸秆、小麦秸秆、大豆秸秆、柳枝稷、浮萍、杨树、木片、木屑、湿酒糟、干酒糟、人类废弃物、新闻纸、回收纸产品或人类垃圾——可以是用本发明的该方法处理。生物质还可源自高-纤维素含量生物,例如柳枝稷或浮萍。用于该方法的酶或多种酶可以从所述生物释放,该释放可涉及化学或机械破坏生物的细胞。在可选的实施方式中,酶或多种酶选自所述生物,然后从培养基中收集。生物质的处理可涉及发酵过程,其可利用微生物而不是产生酶或多种酶的生物。在一些情况下,非维管光合生物可以添加至糖化槽。该本发明的该方法还可包括收集所述生物燃料的步骤。收集可以通过蒸馏进行。在一些情况下,生物燃料与另一种燃料混合。本发明的另外方法提供制备至少一种生物质降解酶,其通过转化叶绿体以制备生物质降解酶。生物质降解酶可以是分解纤维素的酶、分解半纤维素的酶或分解木质素的酶,以及具体地可以是外切_β_葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶或木质酶。在一些情况下,生物质降解酶被隔离在转化的叶绿体中。该方法可进一步涉及通过化学或机械方法破坏转化的叶绿体以释放生物质降解酶或多种酶。在一些情况下,多
种酶将通过转化的叶绿体产生。生物质降解酶可以是真菌或细菌来源,例如,外切葡聚糖酶、内切_β_葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、内切木聚糖酶、木质酶或其组合。本发明还另一个方法提供筛选转化的非维管光合生物,其通过从所述生物的叶绿体中扩增第一核酸序列,从所述生物的叶绿体扩增第二核酸序列以及测定所述生物的原生质状态,其基于从所述第一序列和第二序列扩增的结果。在一些情况下,第一和第二扩增步骤同时进行。第一核酸序列可以是内源叶绿体基因组序列,第二核酸序列可以是至少部分来自外源核酸。在一些情况下,来自叶绿体的第三核酸序列可以作为对照扩增。该第三核酸序列可以是野生型序列,其在外源核酸或多个外源核酸整合后保持完整。其中该第三核酸被扩增,该扩增可与第一或第二扩增步骤同时进行或所有三个扩增可以同时进行。对于该方法的扩增,本文提供的特异性引物——、SEQIDΝ0·2、、,,、、、、、
,,-可以使用。
第一和/或第二核酸的扩增可利用大于三十个循环的PCR。在一些情况下,测定原生质状态通过视觉分析从扩增步骤得到的产物进行。一种或多种扩增可以使用实时或定量