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专利名称:使用***水解酶突变体生产3-羟基羧酸的制作方法
技术领域:
本发明涉及分子生物学和微生物学领域。更具体地说,本发明涉及具有改善的***水解酶活性的突变的***水解酶,所述***水解酶用于将3-羟基***转化为3-羟基羧酸。
背景技术:
具有优异性能、独特性质、改善的成本效率、品质以及低生态影响的新聚合物正引起工业界的注意。特别是,需要具有支链、致密结构以及末端带反应基的功能聚合物,因为与常规线型统计共聚物相比,它们具有更低的特性粘度和更高的活性。这样优异的聚合物可通过共聚高支化(hyperbranching)羟基羧酸共聚单体(高支化ABn型,其中A和B是具有羟基或羧基衍生的反应基部分,η是2或更大)(Hult等,-658禾口Voit等,-659inConcisePolymericMaterialsEncyclopedia,,CRCPress,NewYork,1999)和多种线型羟基羧酸共聚单体(线型AB型)包括3-羟基戊酸(3-HVA)和3-羟基丁酸(3-HBA)得以制备。3-羟基羧酸用作为共聚单体用于制造线型聚酯。聚酯被用作为热塑性、热固性、半结晶、非晶形、刚性和弹性体材料。它们是纤维、薄膜、模制品和涂料的主要成分
(Goodman,-799inConciseEncyclopediaofPolymerScienceandEnRineerinR,,JohnWiley&Sons,NewYork,1990)。已在使用皱落假丝酵母(Candidarugosa)的发酵中通过戊酸的3_羟基化作用制备了3-羟基戊酸(Hasegawa等,:257-262(1981)JP59053838B4),并且通过使用恶臭假单胞菌(I^seudomonasputida)、产蓝色素荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)禾口Arthrobactercrystallopietes,经发酵的戊酸的3-羟基化作用,类似地制备了3_羟基戊酸的单一对映体(,553,081)。这些用于戊酸发酵氧化的方法通常产生低产物浓度的3-羟基戊酸,并且从发酵培养基中分离3-羟基戊酸需要精心设计且费用昂贵。已通过化学降解(Seekich等,:2007-2034(1994))或聚(3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯)发酵自降解(W09929889)制备得到(R)_(_)_3_羟基戊酸,但是羟基丁酸/羟基戊酸共聚物的降解同样需要费力地将3-羟基丁酸与副产物3-羟基戊酸分离。还已通过酶促还原3-氧代戊酸(Bayer等,:543-547(1994))或不对称氢化***3-氧代戊酸酯接着皂化(Burk等,Organometallics9:2653-2655(1990))制备得到(R)-(-)-3-羟基戊酸。通过多种化学方法,***容易地转化为相应的羧酸。这些方法需要强的酸性和
碱性反应条件和高反应温度,且通常产生不需要的副产物和/或作为不需要的废弃物的大量无机盐。用于化学水解额外具有羟基的***的反应条件,例如用于将3-羟基戊***转化为3-羟基戊酸的反应条件,通常会导致不期望的伯、仲或叔羟基消除,产生碳-碳双键。***酶催化水解为相应的羧酸是经常优选的化学方法,因为该反应通常在环境温度下进行,无需强的酸性或碱性反应条件,并以高转化率产生高选择性的所需产物。两种酶——***水合酶和酰***酶的组合可用于在水溶液中将脂肪***转化为相应的羧酸。开始,通过***水合酶将脂肪***转化为酰***,接着,随后通过酰***酶将酰***转化为相应的羧酸。已知多种细菌菌属具有不同的***水合酶和酰***酶活性谱(Sugai等,-1427(1997)),包括红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、产硫杆菌属(Alcaligenes)、节核细菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、无芽孢杆菌属(Bacteridium)lifM(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)禾口微球菌属(Micrococcus)。真菌节镰孢(Fusariummerismoides)TG-I还已用作为催化剂用于水解脂肪***和二***(Asano等,=2497-2498(1980))来自红球菌(Rhodococcussp.)(来自NovoIndustri的SP409)的固定化***水合酶和酰***酶被用于将3-羟基丙***、3-羟基庚***和3-羟基壬***水解为相应的3-羟基羧酸,产率分别为
63%、62%和83%(deRaadt等,,137-140(1992))。使用TLC也观察到了相应的酰***的形成。与此相反,苍白芽孢杆菌(Bacilluspallidas)Dac521的纯化的***水合酶水解多种脂肪***,但不水解3-羟基丙***(Cramp等,-260(1999))。单种酶一***水解酶在水溶液中也将***转化为相应的羧酸和氨,但没有酰***中间体形成(方程式1和2)。
权利要求
:13所示的分离的核酸分子。
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,其中所述微生物选自丛毛单胞菌(Comamonassp.)、棒状杆菌(Corynebacteriumsp.)、fei|f菌(Brevibacteriumsp·)、红球菌(Rhodococcussp·)、固氮菌(Azotobactersp.)、梓樣酸杆菌(Citrobactersp.)、肠杆菌(Enterobactersp.)、梭状芽孢杆菌(Clostridiumsp.)、克雷白氏杆菌(Klebsiellasp.)、沙门氏菌(Salmonellasp.)、乳酸杆菌(Lactobacillussp.)、曲霄(Aspergillussp·)、糖酵母(Saccharomycessp.)
、接合酵母(Zygosaccharomycessp.)、毕赤氏酵母(Pichiasp.)、克鲁维氏酵母(Kluyveromycessp.)、假丝酵母(Candidasp.)、汉森氏酵母(Hansenulasp.)、杜氏藻(Dunaliellasp.)、德巴利氏酵母(Debaryomycessp.)、毛霉(Mucorsp.)、球拟酵母(Torulopsissp.)、***杆菌(Methylobacteriasp·)、芽孢杆菌(Bacillussp.)、埃希氏杆菌(Escherichiasp.)、/[段单胞菌(Pseudomonassp.)、f艮瘤菌(Rhizobiumsp.)禾口链霉菌(Streptomycessp.)。
,其中所述转化的微生物是一种大肠杆菌菌株,选自保藏号为ATCC47076的MG1655、保藏号为ATCC53911的FM5、保藏号为ATCC27325的W3110、保藏号为ATCC35695的MC4100和保藏号为ATCC12435的W1485。
-羟基***水解为3-羟基羧酸的方法,包括步骤(a)将反应混合物水溶液中的3-羟基***与***水解酶催化剂接触,由此所述3-羟基***被水解为相应的3-羟基羧酸,所述***水解酶催化剂为权利要求1的分离的核酸分子所编码;和(b)任选地分离步骤(a)中产生的3-羟基羧酸。
,其中所述3-羟基***是3-羟基戊***或3-羟基丁***。
-羟基戊***水解为3-羟基戊酸的方法,包括步骤
(a)将反应混合物水溶液中的3-羟基戊***与权利要求1的分离的核酸分子编码的***水解酶催化剂接触,由此所述3-羟基戊***被水解为3-羟基戊酸;和(b)任选地分离步骤(a)中产生的3-羟基戊酸。
全文摘要
本发明涉及使用***水解酶突变体生产3-羟基羧酸。本发明涉及具有改善的用于将3-羟基***转化为3-羟基羧酸的***水解酶活性的***水解酶突变体。更具体地说,使用易错PCR和位点定向诱变突变敏捷食酸菌72W(ATCC55746)***水解酶基因以产生具有改善的用于将3-羟基***(如3-羟基丁***或3-羟基戊***)转化为相应的3-羟基羧酸的***水解酶活性的***水解酶。也提供了一种使用所述改善的突变体生产3-羟基羧酸的方法。