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使用胚胎干细胞衍生的微囊泡制备诱导多能性干细胞的方法
本发明提供一种使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞去分化的方法。具体而言,本发明提供一种制备诱导多能性干细胞的方法,所述方法包括用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。根据本发明的制备诱导多能性干细胞的方法,使用胚胎干细胞衍生的微囊泡可使体细胞的去分化有效进行而无副作用,并且,预见到本发明的方法在研发具有个体免疫相容性的细胞疗法产品方面非常有用。
【专利说明】使用胚胎干细胞衍生的微囊泡制备诱导多能性干细胞的方
法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞去分化来制备诱导多能性干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]去分化是成熟体细胞恢复为较年轻的干细胞的过程并且去分化涉及体内再生,这种体内再生在昆虫体内、两栖动物体内、植物体内发生。所述去分化不会自然地发生在诸如人之类的哺乳动物体内,只是通过人工方法在诸如人之类的哺乳动物体内发生。细胞去分化的方法以使用细胞融合的方法为开端。本领域中发现的使体细胞去分化
的第一种方法是使用如下特征的方法:当胚胎干细胞(ESC)与体细胞融合时胚胎干细胞成为占主导地位的细胞。此后,通过将体细胞与除了ESC之外的具有类似于ESC的能力的干细胞融合使在诱导体细胞去分化方面的研究取得了长足发展,所述具有类似于ESC的能力的干细胞例如,胚胎生殖细胞(EGC)或胚胎癌细胞(ECC)。
[0003]然而,进行细胞融合的细胞会随机分裂或维持在融合状态而不进行分裂。发生分裂的细胞(杂合体)具有一个细胞核,而没有发生分裂的细胞(异核体)具有两个不同细胞的细胞核。由于这个原因,大多数细胞成为癌细胞,只有一些细胞具有正常功能。
[0004]此外,检查细胞融合(细胞、细胞质)的方法具有以下不足之处:许多细胞由于使用聚乙二醇(PEG)诱导融合而死亡,聚乙二醇可损伤细胞以帮助大尺寸的细胞进行融合。为了解决这个问题,仅使细胞的一部分而非全部胚胎干细胞去分化的常规研究取得了进展。一项研究工作通过从细胞中仅分离细胞质而在融合过程中排除细胞核。用化学物质(链球菌溶血素)处理体细胞以使细胞膜具有渗透性并嵌入从胚胎干细胞衍生的细胞质的方法得到使用。然而,截止2010年,在使用细胞质去分化的情况下,还没有成功的去分化实例产生与胚胎干细胞类似的性质。
[0005]此外,本领域还存在特异性因子的递送系统。2006年,日本东京大学的Yamanaka研究组发现了可仅通过胚胎干细胞中的四个基因进行去分化。将这四个基因(0ct-4、klf4、Sox2和c-Myc)引入小鼠皮肤细胞,从而制备诱导多能性干细胞(iPS)。这项研究开创了合成细胞的一部分用于嵌入而不是融合整个细胞这一概念。iPS技术采用了一种通过在起始阶段利用病毒的能力将基因嵌入基因组并强制表达RNA生产蛋白质的方法。然而,由于病毒的特性,基因被整合在若干位点,从而形成不理想的修饰。目前,为了解决这个问题,使用mRNA递送方法或者递送蛋白质本身的方法。然而,本领域技术人员发现mRNA易于降解并且合成过程有难度,会诱导RNA的免疫反应,而且仅递送蛋白质无法实现完全去分化。
[0006]因此,本领域亟需研发一种可克服上述问题的制备去分化的多能性干细胞的方法。
【发明内容】
[0007]【技术问题】
[0008]为了解决现有技术中的问题,本发明的发明人进行研究发现,体细胞的去分化可通过使用胚胎干细胞衍生的微囊泡而有效且稳定地进行。
[0009]因此,本发明意在提供一种使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞有效地进行去分化而不产生副作用来制备诱导多能性干细胞的方法,并且本发明还提供通过上述方法制备的诱导多能性干细胞。
[0010]然而,技术问题不限于上面描述的那些,本领域普通技术人员根据下面的描述会清楚地理解本文没有描述的其他技术问题。
[0011]【技术方案】
[0012]本发明一方面提供一种制备诱导多能性干细胞的方法,所述方法包括使用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。
[0013]本发明另一方面提供通过如下方法制备的诱导多能性干细胞,所述方法包括使用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。
[0014]本发明的再一方面提供一种包含诱导多能性干细胞的细胞疗法产品。
[0015]【有益效果】
[0016]根据本发明可知,使用融合微囊泡递送细胞质的方法不需要使用在细胞融合过程中所需的聚乙二醇(PEG)或不需要使用注入细胞质时所用的诸如链球菌溶血素之类的细胞毒性物质,因此,对细胞的损伤较小。此外,在递送细胞质的过程中,微囊泡具有较高的递送效率,并且更有效地保护递送的内容物,因此能够特异性地递送细胞质。根据细胞质递送方面的常规研究可知,细胞质的递送效
率随着细胞核内待表达的蛋白质的量的减少而减少,因此,无法进行完全去分化。然而,基于本发明的制备方法,本发明的微囊泡可自由地控制细胞质的浓度并且防止融合过程中细胞内物质的损失,这样,使用细胞质使体细胞去分化的效率可增加。
[0017]此外,根据使用本发明的微囊泡的方法可知,靶向诱导体内去分化的目标是可能的。具体而言,因为在患者的受损器官中产生的信号是主要靶向因子,所以,可预见到的是,体外去分化会成为能够在体内进行的新的去分化方式。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1表示通过挤压制备的胚胎干细胞衍生的微囊泡的透射电子显微镜(TEM)图像。
[0019]图2为表示通过挤压制备的胚胎干细胞衍生的微囊泡的尺寸的图。
[0020]图3为表示胚胎干细胞特异性蛋白质(即,0ct3/4)存在于胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的微囊泡中的图。
[0021]图4为表示胚胎干细胞特异性基因(即,0ct3/4和Nanog)存在于胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的微囊泡中的图。
[0022]图5表示在使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)去分化之后产生的细胞集落。
[0023]图6表示在使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)去分化并随时间进行增殖之后产生的细胞集落。[0024]图7表示在使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使GFP转染的小鼠成纤维细胞(NIH3T3-GFP细胞)去分化之后产生的细胞集落。
[0025]图8为表示胚胎干细胞特异性基因(即,0ct3/4和Nanog)在去分化的小鼠成纤维细胞(NIH3T3去分化的细胞)中表达的图。[0026]图9表示去分化的小鼠成纤维细胞(NIH3T3去分化的细胞)具有分化能力。
[0027]图10为表示分化特异性基因(即,AFP、Foxfl和β-1II微管蛋白)在去分化的小鼠成纤维细胞(ΝΙΗ3Τ3去分化的细胞)分化时表达的图。
[0028]图11表示在通过胚胎干细胞衍生的微囊泡与布雷菲德菌素A(BFA)联合处理使小鼠成纤维细胞(ΝΙΗ3Τ3细胞)去分化之后产生的细胞集落。
【具体实施方式】
[0029]本发明提供一种制备诱导多能性干细胞的方法,所述方法包括使用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞,从而使体细胞去分化。
[0030]本发明使用的胚胎干细胞可来源于人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛,但是本发明不限于此。
[0031]本文使用的“微囊泡”被脂质双层分为内侧和外侧,所述脂质双层由衍生的细胞的细胞膜成分构成,所述微囊泡包括所述细胞的细胞膜脂质、细胞膜蛋白质、核酸和细胞成分,并且所述微囊泡的尺寸比原始细胞的尺寸小,但是本发明不限于此。
[0032]本发明的微囊泡可通过如下方法由包含胚胎干细胞的悬浮液制备,所述方法选自:挤压、超声处理、细胞溶解、同质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解以及用化学物质处理,但是本发明不限于此。
[0033]在本发明的一种实施方式中,微囊泡的膜还可包含不同于胚胎干细胞的细胞膜的成分。
[0034]不同于细胞膜的成分可包括靶向分子、细胞膜与靶细胞融合所必需的物质(融合剂)、环糊精、PEG,等等。此外,不同于细胞膜的成分可通过各种不同的方法添加,所述方法包括细胞膜的化学修饰。
[0035]例如,微囊泡的膜成分可通过使用巯基(-SH)或氨基(-NH2)的化学方法或通过将PEG化学连接至微囊泡被化学修饰。
[0036]本发明可进一步包括在制备本发明的微囊泡的过程中对微囊泡的膜成分进行化学修饰。
[0037]此外,本发明的胚胎干细胞包括转化的细胞。具体而言,所述转化的细胞包括被转化为表达细胞膜与特定蛋白质、靶分子或靶细胞融合所必需的物质的细胞,并且所述转化的细胞还包括由至少两种转化的细胞组合构成的转化的细胞,但本发明并不限于此。
[0038]胚胎干细胞可通过物质的处理或转导被转化,并且所述胚胎干细胞可被转化至少两次。
[0039]在本发明的另一实施方式中,胚胎干细胞可被转化为抑制至少一种特定蛋白质的表达。
[0040]在本发明的又一实施方式中,胚胎干细胞可被转化为表达选自细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白以及它们的融合蛋白中的至少一种。[0041]在本发明的又一实施方式中,胚胎干细胞可被转化为过表达胚胎干细胞特异性蛋白质,即,0ct3/4、Nanog或者Sox_2蛋白质。
[0042]在本发明的又一实施方式中,本发明的组合物还可包括不同于胚胎干细胞衍生的微囊泡的成分。
[0043]例如,包含胚胎干细胞衍生的微囊泡和刺激体细胞去分化的物质的组合物可用于处理体细胞。额外的物质包括布雷菲德菌素A(BFA)、BiP诱导物X(BIX)和丙戊酸(VPA)。
[0044]下文中提供示例性的实例以帮助理解本发明。然而,本发明提供的下列实例可能更加易于理解本发明,但是本发明的范围不限于实施例。
[0045]
[0046]以5XIO6个细胞/ml的浓度将小鼠胚胎干细胞重悬于
3ml磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中。使重悬液流过孔径为IOym的膜过滤器10次,流过孔径为5μπι的膜过滤器10次。将lml50%0ptiPr印?、lml5%0ptiPr印"和3ml流过膜过滤器的细胞悬浮液放置于5ml超速离心管中。随后,在100,OOOXg的条件下进行超速离心处理持续2小时。在50%0ptiPi^p?和5%0ptiPrep?之间的层中获得微囊泡。
[0047]
[0048]将根据实施例1所述的方法由胚胎干细胞制备的微囊泡吸附在辉光放电碳包被的铜网上持续3分钟。用蒸馏水洗涤所述网并且用2%乙酸铀酰染色I分钟,使用透射电子显微镜JEMlOl(Jeol,Japan)观察到的结果如图1所示。
[0049]如图1的TEM图像所示,可以看到通过挤压由胚胎干细胞制备的微囊泡由脂质双层构成,并且通常形成尺寸为IOOnm至200nm的球形。
[0050]将实施例1所述的由胚胎干细胞制备的微囊泡稀释于ImlPBS中,使其浓度达到5ug/,结果如图2所示。
[0051]图2所示的结果证实了微囊泡的尺寸为50nm至IOOnm,平均尺寸为70nm。
[0052]根据实施例1所述的方法由胚胎干细胞制备50μg微囊泡,并制备10μg胚胎干细胞的全细胞裂解物,加入5X
上样染料(250mMTris-HCl,10%SDS,%溴酚蓝,50%甘油),使上样染料的终浓度为IX上样染料,在100°C下处理得到的溶液5分钟。制备8%聚丙烯酰***凝胶,随后上样。在80V的条件下对样品进行电泳分离持续2小时,并在400mA的条件下将蛋白质转移至聚偏***乙烯(PVDF)膜持续2小时。将脱脂牛奶溶于PBS中,使浓度达到3%,并在该溶液中封闭所述膜2小时。在4°C条件下用0ct3/4和β-肌动蛋白的抗体处理所述膜12小时。用PBS洗涤得到的膜两次,在室温下再用连接有过氧化物酶的二抗处理所述膜I小时。得到的膜用PBS洗涤30分钟并使用增强化学发光(ECL;)底物进行鉴定,结果如图3所示。
[0053]图3所示的结果证实了由胚胎干细胞制备的微囊泡中存在胚胎干细胞特异性蛋白质,即0ct3/4。
[0054]使用RNeasy'kMini试剂盒(QIAGEN,),从根据实施例1所述的方
法由胚胎干细胞制备的微囊泡和胚胎干细胞中提取总基因(RNA)。使用特异性基因引物和PCR试剂盒(BIOLAB,)从提取的RNA中获得多种cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,并且使用溴化乙锭(ETBR)染色进行鉴定。为了保证使用相同量的RNA作为阳性对照(胚胎干细胞),还一同鉴定了管家基因(甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH))。使用5’-AGACCATGTTTCTGAAGTGC-3’作为胚胎干细胞特异性基因