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使用细菌细胞色素p450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于其的组合物的制作方法
本发明涉及一种使用细菌细胞色素P450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于该新方法的组合物,更具体而言,涉及用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的组合物和试剂盒及其制备方法,所述组合物和试剂盒含有细菌细胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突变形式。所述组合物、试剂盒和方法能够从奥美拉唑经济高效地大规模制备5'-羟基产物,因此会对使用奥美拉唑的代谢物的新型药物的开发作出显著贡献。
【专利说明】使用细菌细胞色素P450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于其的组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种使用细菌细胞色素P450从奥美拉唑制备代谢物的新方法和用于该新方法的组合物,更具体而言,涉及用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的组合物和试剂盒及其制备方法,所述组合物和试剂盒含有细菌细胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突变形式。
【背景技术】
[0002]奥美拉唑是质子泵抑制剂,已知其是消化不良、胃溃瘍、胃食管反流病和咽喉反流
病的治疗剂。奥美拉唑是外消旋体,含有比例为50:50的S和R对映异构体。在以上酸性条件下,这两种对映异构体都转化成非手性化合物,并且与H+/K+ATP酶的半胱氨酸基团反应,从而抑制胃壁细胞中的胃酸产生。奥美拉唑和对映异构体被存在于人肝脏中的细胞色素P450CYP2C19和CYP3A4代谢,其主要代谢物包括5'-0-脱***奥美拉唑、5'-和3'-羟基奥美拉唑以及奥美拉唑讽(参见Renberg等,DrugMetabDispos17:69-76,1989;Andersson等,ClinPharmacokinet40:411-426,2001;Li等,JPharmacolExpTher315:777-787,2005)。据报道,R对映异构体通常被CYP2C19代谢为5'-0-脱***奥美拉唑、5'-羟基奥美拉唑,S对映异构体通常被CYP3A4代谢为奥美拉唑砜、3'-羟基奥美拉唑。
[0003]细胞色素P450(P450或CYP)酶是个大家族,该家族由多种酶组成,这些酶充当从古细菌至细菌、真菌、植物、动物和人的整个自然界中的多种多样的氧化反应的催化剂。由于催化功能的多样性以及其底物范围广,P450可大规模地用作制备精细化工品(包括药物供应等)时的生物催化剂(参见Guengerich,NatRevDrugDiscovl:359_366,2〇〇2;Urlacher等,TrendsBiotechnol24:324-330,2006;YunCH等,TrendsBiotechnol25:289-298,2007;Lamb等,CurrOpinBiotechnol18:504-512,2007)。但是,虽然哺乳动
物的细胞色素P450酶在各种上述生物【技术领域】中具有潜在的可用性,但是P450的稳定性、催化活性和可获得性较低,因此不适合作为生物催化剂。
[0004]当在开发药物期间人利用P450将前药转化为生物"活性代谢物"时(参见Johnson等,:151-159,2004),需要大量的纯代谢物来研究该药物的功效、毒性和药代动力学等。此外,当代谢物自身具有生物活性时,体内直接施用所述代谢物具有巨大裨益,因此大规模生产所述代谢物是重要的。
[0005]当将奥美拉唑施用至人体中时,由于奥美拉唑被CYP2C19和CYP3A4代谢,代谢物产生的速率会根据酶的表达程度而有所不同。另外,会出现药物与被所述酶代谢的其他药物相互作用的问题。因此,当将奥美拉唑代谢物直接用作药物时,可以避免药物相互作用问题。
[0006]但是,由于在化学合成纯代谢物时存在各种问题,为了以替代代谢物化学合成的方式产生药物代谢物或药物候选物,使用了P450。已经报道了使用表达自大肠杆菌(参见Yun等,CurrDrugMetab7:411_429,2〇〇6)或昆虫细胞(参见Rushmore等,MetabEng2:115-125,2000;Vail等,JIndMicrobiolBiotechnol32:67-74,2005)的人P450来生产所述代谢物。但是,由于稳定性有限和反应速率低等原因,这些体系具有诸如成本昂贵和产生率低等问题(参见Guengerich
等,CritRevToxicol26:551_583,1996)。因此,已经提出了使用具有所需催化活性的工程化细菌P450酶作为用于产生人体中的代谢物的替代途径的方法(参见YunCH等,TrendsBiotechnol25:289-298,2007)。
[0007]同时,源自巨大芽抱杆菌(Bacillusmegaterium)的P450BM3(CYP102A1)的血红素结构域具有单加氧酶活性,其与CYP4A(脂肪酸羟化酶)家族的哺乳动物成员极其相似。天然地,其由单个的多肽构成,其中,具有哺乳动物样二黄素还原酶功能的CYP102A1还原酶结构域融合至P450血红素结构域的C末端。两种酶活性的融合使得融合性CYP102A1成为期望的哺乳动物模型,特别是人P450酶的期望模型。据报道,通过逻辑性设计或定向进化而遗传改造得到的突变CYP102A1可氧化人P450的若干种底物,从而产生具有更高活性的代谢物(参见Kim等,DrugMetabDispos36:2166-2170,2008;Kim等,DrugMetabDispos37:932-936,2009;Kim等,JMolCatalB:Enzym63:179-187,2010;0tey等,BiotechnolBioeng93:494_499,2006;YunCH等,TrendsBiotechnol25:289-298,2007)。
[0008]基于上述描述,已提出可以开发突变的CYP102A1作为用于药物的检测和合成的生物催化剂。最近已报道,数种选出的突变形式可以允许CYP102A1酶产生人体中的代谢
物作为药物(参见Kim等,DrugMetabDispos36:2166_2170,2008;Kim等,DrugMetabDispos37:932-936,2009),但是,尚未报道过以生物学手段从奥美拉唑产生人体中的代谢物的方法。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种在通过氧化奥美拉唑而产生5'-羟基产物的选择性转化反应中能够更稳定更有效地发挥催化功能的酶。
[0010]另外,本发明的另一目的在于提供一种用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的组合物,所述组合物含有所述酶。
[0011]此外,本发明的另一目的在于提供一种从奥美拉唑制备5'-羟基产物的方法,所述方法包括使所述酶与奥美拉唑反应。
[0012]另外,本发明的另一目的在于提供一种用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的试剂盒,所述试剂盒含有所述酶和产生NADPH的体系。
[0013][技术方案]
[0014]在一个总体方面,本发明提供选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的组的至少一种酶。
[0015]所述酶可以在通过氧化奥美拉唑而产生5'-羟基产物的选择性转化反应中更稳定更有效地发挥催化功能。
[0016]在另一总体方面,本发明提供一种使用野生型
CYP102A1和突变的CYP102A1从奥美拉唑选择性地大规模制备人体中的代谢物、特别是5'-羟基产物的方法,以及用于该方法的组合物和试剂盒,其中,CYP102A1是细菌P450酶。
[0017]本发明的野生型CYP102A1和突变的CYP102A1可以用作以奥美拉唑作为底物的氧化反应中的催化剂,已知奥美拉唑是人P450的底物;特别而言,使用人CYP2C19作为催化剂时产生的奥美拉唑代谢物包括两种代谢物;而使用本发明的细菌CYP102A1或其突变形式作为催化剂时,可以选择性地产生5'-羟基产物。
[0018]在本发明的优选示例性实施方式中,本发明人确认了当细菌野生型CYP102A1和其定点突变形式在大肠杆菌中大规模表达(参见表1和2)且使奥美拉唑与产生NADPH的体系反应时,通过HPLC(参见图3、4和5)和LC-MS谱(参见图6)确认奥美拉唑转化成了人体中的代谢物。经确认,在使用人CYP2C19时,奥美拉唑被氧化产生两种主要代谢物,即3'-羟基奥美拉唑和5'-羟基奥美拉唑;但在使用细菌野生型CYP102A1及其突变形式时,选择性地产生了一种主要产物,即5'-羟基奥美拉唑。
[0019]在产物的产生方面,野生型CYP102A1、17种突变形式和6种突变嵌合形式具有范围很宽的分子催化活性(转换数)(参见图5)。经确认,对于在总分子催化活性方面显示出高活性的突变#10,在以ImM浓度(A)的奥美拉唑反应
2?4小时(B)的反应中显示出了最高活性;同时,对于野生型CYP102A1酶,几乎不显示对于奥美拉唑的活性(参见图7)。
[0020]基于上述检验结果,在另一总体方面,本发明提供一种用于从奥美拉唑制备5'-羟基产物的组合物,所述组合物含有选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的组的至少一种酶,
[0021]其中,所述突变的CYP102A1具有由氨基酸序列SEQIDN0:16表示的野生型CYP102A1被修饰后的序列,所述修饰为选自由以下替换组成的组的至少一种:第48位氨基酸精氨酸(R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第52位氨基酸酪氨酸(Y)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第65位氨基酸谷氨酸(E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;第75位氨基酸丙氨酸(A)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;第82位氨基酸苯丙氨酸(F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第87位氨基酸亮氨酸(L)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色
氨酸组成的组的氨基酸替换;第88位氨基酸苯丙氨酸(F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第144位氨基酸谷氨酸(E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;第189位氨基酸亮氨酸(L)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;和第268位氨基酸谷氨酸(E)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换。
[0022]所述奥美拉唑可以是含有作为对映异构体的S-或R-奥美拉唑的外消旋体,或是比例为50:50的S-和R-奥美拉唑的对映异构体,但是本发明不限于此。
[0023]在另一总体方面,本发明提供一种从奥美拉唑制备5'-羟基产物的方法,所述方法包括使奥美拉唑与选自由野生型CYP102A1和突变的CYP102A1组成的组的至少一种酶反应。
[0024]在所述制备5'-羟基产物的方法中,所述突变的CYP102A1可以优选具有由氨基酸序列SEQIDNO:16表示的野生型CYP102A1被修饰后的序列,所述修饰选自由以下替换组成的组的至少一种:第48位氨基酸精氨酸(R)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第
52位氨基酸酪氨酸(Y)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第65位氨基酸谷氨酸(E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;第75位氨基酸丙氨酸(A)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;第82位氨基酸苯丙氨酸(F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第87位氨基酸亮氨酸(L)被选自由丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第88位氨基酸苯丙氨酸(F)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换;第144位氨基酸谷氨酸(E)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;第189位氨基酸亮氨酸(L)被选自由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***组成的组的氨基酸替换;和第268位氨基酸谷氨酸(E)被选自由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸组成的组的氨基酸替换。
[0025]在本发明中,突变的CYP102A1可以通过本领域已知的任何已知突变方法来制造,
例如缺失突变法(,.,15,4457)、PCT法、Kunkel法、定点突变法、DNA改组、交错延伸法(StEP)和易错PCR等。
[0026]在本发明的突变的CYP102A1中,由SEQIDN0:16表示的野生型CYP102A1蛋白的氨基酸序列通过天然或人工的替换、缺失、添加和/或插入而被修饰。优选的是,按照以下分类,所换上的氨基酸可以具有与待替换的氨基酸相似的性质。例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸都被分类成非极性氨基酸,并且彼此具有相似的性质。不带电氨基酸的实例可以包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰***和谷氨酰***等,酸性氨基酸的实例可以包括天冬氨酸和谷氨酸,碱性氨基酸的实例可以包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
[0027]本发明的突变的CYP102A1包括含有与由SEQID勵:16表示的0￥?102八1蛋白序列具有至少50%同一'丨生、优选至少75%同一'丨生、更优选至少90%同一'丨生的氨基酸序列的多肽。
[0028]野生型CYP102A1的期望突变形式可以包括对SEQIDN0:16所表示的野生型CYP102A1进行的选自由以下替换组成的组的至少一种替换:第48位氨基酸精氨酸(R)被亮氨酸(L)替换;第52位氨基酸酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)替换;第65位氨基酸谷氨酸(E)被甘氨酸(G)替换;第75