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专利名称:使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物的制作方法
使用用于癌症的辅佐治疗的李斯特菌属的方法和组合物本发明要求2010年5月23日提交的美国临时专利申请61/347,447的优先权,包括所有表格、附图
和权利要求的其全部内容特此并入。关于联邦政府赞助研究的声明美国政府具有本发明的全额支付许可证以及在限制的情况下具有在根据美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)授予号NHI1K23CA104160-01所提供的合适的条款下要求专利权人许可其他人的权利。
背景技术:
据认为,建立对特异性病原体的强细胞免疫是所需的。已经证明,使用相同疫苗的重复施用(同源性加强)对于加强体液应答是有效的。然而,因为之前对载体的免疫倾向于损坏强抗原呈递和合适炎症信号的生成,所以该方法对加强细胞免疫相对无效。规避该问题的一种方法为连续施用使用不同抗原依赖性系统(异源性加强)的疫苗。该方法称为“初免-加强(prime-boosting)”。以下是异源性初免-加强方案的例子。涉及DNA初免的那些包括DNA初免针对病毒抗原的DNA初免/细菌加强(李斯特菌属)(Boyer等(2005)Virology333:88-101)
;DNA初免/细菌载体(芽孢杆菌属)加强,针对细菌抗原(Ferraz等(2004)InfectionImmunity72:6945-6950);DNA初免/病毒载体加强,针对肿瘤抗原(Goldberg等(2005):8114-8121;Smith等(2005):259-266);针对病毒抗原的DNA初免/病毒加强(Toussaint等(2005)Vaccine23:5073-5081;Cebere等(2006)Vaccine24:417-425;Coupar等(2006)Vaccine24:1378-1388);针对病毒抗原的DNA初免/蛋白加强(Cristillo等(2006)Virology346:151-168;Rasmussen等(2006)Vaccine24:2324-2332);DNA初免/病毒加强,针对寄生虫的抗原(Gilbert等(2006)Vaccine24:4554-4561;Webster等(2005):4836-4841);DNA初免/辅佐的蛋白加强,针对肿瘤抗原(Prud'homme(2005):3-17);DNA初免/病毒加强以及蛋白加强,针对病毒抗原(Stambas等(2005)Vaccine23:2454-2464);以及DNA初免(纳米颗粒)/蛋白加强,针对病毒抗原(Castaldello等(2006)Vaccine24:5655-5669)。以下异源性初免-加强方案利用不涉及DNA的初免组合物树状细胞(DC)初免/细菌(李斯特菌属)加强、以及DC初免/病毒加强,针对细菌抗原(Badovinac等(2005):748-756);细菌载体初免(沙门氏菌属)/蛋白加强,针对细菌抗原(Vindurampulle等(2004)Vaccine22:3744-3750
;Lasaro等(2005)Vaccine23:2430-2438);辅佐的蛋白初免/DNA加强,针对病毒抗原(Sugauchi等(2006):563-572;Pal等(2006)Virology348:341-353);蛋白初免/细菌载体(沙门氏菌属)加强,针对病毒抗原(Liu等(2006)Vaccine24:5852-5861);蛋白初免/病毒载体加强,针对病毒抗原(Peacock等(2004):13163-13172);异源性病毒初免/病毒加强,使用不同病毒载体,针对病毒抗原或肿瘤抗原(Ranasinghe等(2006)Vaccine24:5881-5895;Kaufman等(2004):2122-2132;Grosenbach等(2001):4497-4505)。使用脂囊泡的异源性初免/加强,针对细菌抗原(Luijkx等(2006)Vaccine24:1569-1577)。用于调控免疫系统的试剂是李斯特菌属以及特别地为单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。单核细胞增生性李斯特菌具有对肝脏和脾脏以及一定程度对诸如小肠的其他组织的天然向性(参见,例如,Dussurget等(2004):587-610;Gouin等(2005)Curr·:35-45;Cossart(2002):401-409;Vazquez-Boland等(2001):584-640;Schluter等(1999):188-195)对于细菌位于肠道,则通过诸如ActA和internalinA的李斯特菌属蛋白来介导至血流的通道
(参见,例如,Manohar等(2001)InfectionImmunity69:3542-3549;Lecuit等(2004):6152-6157;Lecuit和Cossart(2002):537-542)。一旦细菌进入宿主细胞,单核细胞增生性李斯特菌的生命周期包括从吞噬溶酶体脱逸至胞质溶胶。该生命周期对比于分枝杆菌属(Mycobacterium),其仍旧在吞曬溶酶体内(参见,例如,Clemens等(2002)InfectionImmunity70:5800-5807;Schluter等(1998):5930-5938;Gutierrez等(2004)Cell119:753-766)。单核细胞增生性李斯特菌从吞噬溶酶体中的脱逸通过诸如猪单核细胞增生李斯特菌素(Iysteriolysin)(LLO)、PI-PLC和PC-PLC的李斯特菌属蛋白介导(参见Portnoy等(2002):409-414)。对比以上所讨论的免疫治疗方法,其中免疫疗法用作主要治疗;辅助疗法是指在主要疗法之前(“新辅助疗法”)或者之后(“辅佐”)使用次要治疗,例如手术或辐射,其中主要疗法旨在去除或者破坏主要肿瘤。例如,在手术之后可提供辅助疗法,其中已经去除可检测的疾病,但是由于隐藏疾病还存在复发的统计学风险。对于包括结肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和一些妇科癌症的许多类型的癌症,手术之后提供辅助系统疗法和辐射疗法。
发明概要本发明提供采用李斯特菌属细菌用于癌症的次级治疗的辅助疗法方案。在已经向受试者施用一次或者多次初级治疗之前或之后,施用表达癌症相关抗原的有效量的李斯特菌属疫苗。本发明包括包装在合适的容器中的含有基于李斯特菌属的疫苗的试剂盒,以及可包括说明书。在第一方面,本发明涉及罹患癌症的哺乳动物的辅佐治疗的方法,该方法包括在向所述哺乳动物施用主要疗法之前或之后向所述哺乳动物施用有效量的组合物作为辅佐治疗以去除或者杀死表达癌症抗原的癌症细胞,所述组合物包含减毒的、代谢活性李斯特菌属,所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。如上所述,可将本发明的组合物提供作为新辅助疗法;然而在优选的实施方案中,在主要疗法之后施用本发明的组合物。在各个实施方案中,所述主要疗法包括去除所述哺乳动物的所述癌症细胞的手术;杀死在所述哺乳动物中所述癌症细胞的辐射疗法;或者所述手术以及所述辐射疗法。因为李斯特菌属可以为病原生物,以及特别是在免疫功能不全的情况下,优选所述施用步骤包括以多剂量施用所述减毒的、代谢活性李斯特菌属,所述减毒的、代谢活性李斯特菌属编码所述癌症抗原的可表达的、免疫活性部分。“减毒”是指藉此修饰细菌以减轻或者消除它的病原性但是仍保留用作目标疾病的预防或治疗的能力的方法。通过不同机制可获得细菌减毒。一种是引入突变至一种或者多种代谢途径内,其功能对于细菌体内生存和生长以致病是关键的。在李斯特菌属的情况下,在某些实施方案中,使细菌突变以减轻或者预防细胞内生长和扩散的能力。优选的李斯特菌属可包括使
ActA失活的突变;使InlB失活的突变;或者两者。最优选地,在本发明中采用缺失它的天然ActA和inlB基因(AactAAinlB)的减毒的、代谢活性李斯特菌属。在某些实施方案中,本方法采用被杀死但具代谢活性的李斯特菌属("KBMA")。通过本发明的组合物提供编码各种癌症抗原的任意类型的一种或多种核酸的重组表达。在某些实施方案中,癌症抗原全部或者一部分是间皮素。其他合适抗原详细描述如下,以及可取决于待治疗的癌症类型以及通过癌症待表达的抗原。在各个实施方案中,待治疗的癌症选自胰腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和间皮瘤。该清单并非旨在限制。
除了优选为如所述的手术或辐射的主要疗法之外,可将本发明的组合物递送作为初免-加强方案的一部分。例如,在施用本发明的李斯特菌属组合物之间,已经预先向哺乳动物施用表达目标癌症抗原的来自人细胞系的细胞,其中所述细胞已经被重组修饰以生成和分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,以及其中已通过辐射修饰所述细胞以防细胞分裂(SP’GVAX疫苗,CellGenesys,Inc.)。应理解,本发明在其应用时并不限于构造细节以及在以下描述中阐述或者附图中所图示的组分的布置。本发明能够具有实施方案
(除了描述的那些实施方案之外)以及能够以各种方法实施和进行。而且,应理解,本文所采用的措辞和术语以及摘要用于描述的目的以及不应当视为限制。就其本身而言,本领域技术人员应理解,可容易地利用该公开基于的概念作为设计进行本发明的多种目的的其他结构、方法和系统的基础。因此,重要的是,只要它们未偏离本发明的精神和范围,权利要求就应被视为包括在这些等同构造内。附图简述图IA是显示使用表达抗原的单核细胞增生性李斯特菌和牛痘病毒的初免-加强方案所致的对靶抗原(OVA)的OVA特异性细胞免疫应答的图。显示在ICS测定中使用0VA257-264肽(SIINFEKL(SEQIDNO:I))接种的C57BL/6小鼠中的OVA特异性应答。图IB是显示由使用表达靶抗原(人间皮素)的单核细胞增生性李斯特菌和腺病毒的初免-加强方案所致的人间皮素特异性细胞免疫应答的图。图2是显示由使用单核细胞增生性李斯特菌、腺病毒和牛痘病毒的初免-加强方案所致的在Balb/c小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答的图。也图示初免-加强方案。图3A是显示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的单核细胞增生性李斯特菌加强的初免-加强方案所致的在C57BL/6(HLA-A2转基因)小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答的图(使用间皮素肽池(peptidepool)来刺激脾细胞)。图3B显示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的单核细胞增生性李斯特菌加强的初免
-加强方案所致的在Balb/c小鼠中人间皮素特异性细胞免疫应答(使用间皮素肽池来刺激脾细胞)。也图示初免-加强方案。图4A显示在图的左侧,其显示由具有预先存在的对腺病毒的免疫的小鼠中腺病毒初免所致的人间皮素特异性细胞免疫应答。也在图4A中显示如使用类型IHex3表位(腺病毒特异性表位)测定的腺病毒特异性应答。也图示初免-加强方案。图4B是显示在具有预先存在的对腺病毒的免疫的小鼠中由腺病毒初免和单核细胞增生性李斯特菌加强所致的人间皮素特异性细胞免疫应答和中和腺病毒特异性抗体的滴度的图。也图示初免-加强方案。图5是显示由使用GVAX(CELLGENESYS,INC.)或者编码AHl的单核细胞增生性李斯特菌的初免以及使用GVAX(CELLGENESYS,INC.)或者编码AHl的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的AHl特异性细胞免疫应答的图。图6A是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞或者编码人间皮素的腺病毒的初免以及使用编码人间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的在CD8+T细胞中的间皮素131_139特异性应答的百分率的图。初免发生在第O天;加强发生在第8天;以及在第13天收获脾细胞。·
图6B是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞或者编码人间皮素的腺病毒的初免以及使用编码人间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强所致的每个脾脏中间皮素
131-139特异性⑶8+T细胞的绝对数的图。初免发生在第O天;加强发生在第8天;以及在第13天收获脾细胞。图6C是显示由使用经间皮素肽131-139脉冲的树状细胞的初免以及使用以下编码间皮素试剂的加强所致的在CD8+T细胞中间皮素131-139特异性应答的百分率的图单核细胞增生性李斯特菌、腺病毒或牛痘病毒。图7A是显不在脾细胞中小鼠间皮素特异性免疫应答的图,其中评估在小鼠间皮素肽文库中各肽的免疫应答。Balb/c小鼠接受使用编码小鼠间皮素的裸DNA载体的初免以及使用编码小鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强。图7B是显不在脾细胞中小鼠间皮素特异性免疫应答的图,其中评估在小鼠间皮素肽文库中各肽的免疫应答。Balb/c小鼠接受使用编码小鼠间皮素的腺病毒的初免以及使用编码小鼠间皮素的单核细胞增生性李斯特菌的加强。也图示初免-加强方案。图7C是显示酶联免疫斑点法(elispot)测定的结果的孔相片的半色调再现(hali-tonereproduction),其中从小鼠(其研究结果显示在图7B中)获得的脾细胞暴露于间皮素肽编号278(SEQIDNO:2),279(SEQIDNO:3)或者280(SEQIDNO:4)。图8是显示由使用编码OVA的KBMA单核细胞增生性李斯特菌作为初免以及KBMA单核细胞增生性李斯特菌、牛痘病毒或“活”单核细胞增生性李斯特菌作为加强的初免-加强方案所致的OVA特异性细胞免疫应答的图。所有
“加强”载体编码0VA。图9A显示在接种小鼠中AH-和AH1/A5-特异性T细胞应答。图9B显示在接种小鼠中间皮素特异性T细胞应答。图9C显示在CT26肿瘤激发(tumorchallenge)之后接种的小鼠的生存数据。发明详述本发明涉及用于引起对作为非李斯特菌属抗原的靶抗原的免疫应答的材料和方法。靶抗原优选为与疾病相关的靶抗原,使得对靶抗原的免疫应答提供治疗作用。本发明提供癌症的辅佐治疗的疫苗组,其中基于李斯特菌属的疫苗是代谢活性李斯特菌属,该代谢活性李斯特菌属编码其被施用的宿主中表达的靶抗原的免疫活性部分。
本发明部分基于施用疫苗的辅助使用可增强大量原发癌治疗的发现,该疫苗由编码癌症相关的抗原(例如间皮素)的活的减毒的单核细胞增生性李斯特菌组成。除非另有说明,否则本发明的实施采用包括分子生物学(包括重组技术)、免疫学、细胞生物学、生物化学和药物规程的常规技术。这些技术完整解释在文献中,例如,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,(Sambrook等);MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);CurrentProtocolsinMolecularBiology();CurrentProtocolsinImmunology(JohnWiley&Sons,Inc.,.);HandbookofPharmaceuticalExcipients(Rowe等编辑);Vaccine(PlotkinandOrenstein,2003)