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专利名称:使用有产油能力的微生物生产脂肪酸烷基酯的方法
技术领域:
本发明涉及ー种使用有产油能力的微生物生产脂肪酸烷基酯的方法,尤其涉及一种生产脂肪酸烷基酯的方法,所述方法包括培养有产油能力的微生物,从而在微生物内积累大量油,诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸,并且将该游离脂肪酸转变成烷
背景技术:
近来,由于高油价以及环境方面的考虑,微生物生产生物燃料受到了极大关注。此外,生物柴油已经取代轻油或者出现了生物柴油和轻油的混合物作为替代燃料应用于柴油发动机,因此生物柴油的市场迅速扩大。2008年,欧盟(EU)生产了660万吨生物柴油,市场份额为55亿欧元(BiodieselMarket,Frost&Sullivan)。另外,2006年美国生产了30亿加仑生物柴油(BiodieselMarket,GlobalIndustryAnalystsInc,)。生物柴油的优势在于其具有高燃烧率,因而有毒气体排放量低,较之轻油热值约低10%,但燃点更高,表明其在存储和运输期间更为稳定。生物柴油主要是通过处理动物和植物的脂肪成分来生产,从而使其具有类似于轻油的性质,或者通过植物油脂(米糠、烹饪废油、大豆油、菜籽油等等
)与乙醇反应而制得。然而,在这种情况下的缺点是难以大量生产生物柴油。因此,如果能通过使用微生物大量生产生物柴油作为轻油的代用燃料,将减少原油的进ロ及温室气体的排放,使得环境改善。同吋,油是ー种能量载体,当微生物富有碳源而缺乏其它生长因子(氮、磷、氧、硫、等等)吋,油可在微生物細胞内合成并积累。当微生物的生长环境改变,而向微生物提供其它生长因子吋,所积累的油将被降解并且用作能源。众所周知,由于产油微生物的种类、所提供的化学原料的种类、培养条件等的不同,油可由超过100种单体組成。近来,已经开发了向植物(如甘蔗)脂肪酸中添加醇来生产脂肪酸烷基酯的技木,所生产的脂肪酸烷基酯目前正被用作生物柴油。此外,欧洲专利EP127104A、EP184740A和美国专利4,164,506中也公开了酯化游离脂肪酸的方法。根据这些专利的公开内容,酷化反应通过加热脂肪酸和甘油三酯以及甲醇的混合物来进行。另外,欧洲专利申请EP708813A公开了ー种提高油脂生产脂肪酸烷基酯的产量的方法,其中将游离脂肪酸与酷交換得到的甘油分离,然后进行酯化。然而,很难用这种方法获得大量脂肪酸或者游离脂肪酸。另外,由于植物的生长期很长而且生产植物脂肪酸的代谢工程方法有些困难,因而很难増加目前常用的植物脂肪酸的积累和产生。因此,本发明人通过大量努力,提出了ー种通过代谢工程途径高效且高产地生产被用作生物柴油的脂肪酸烷基酯的新方法,并且结果发现使用代谢工程方法,通过使产油微生物最大化地生产油,然后诱导微生物中的油自溶
生产游离脂肪酸,然后游离脂肪酸转变为烷基酷,可高效生产脂肪酸烷基酷,从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供ー种通过代谢工程途径高效且高产地大量生产可用作生物柴油的脂肪酸烷基酯的新方法。为了达到上述目标,本发明提供一种生产脂肪酸烷基酯的方法,该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力的微生物以生产油;(b)诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸;以及(c)向所生产的游离脂肪酸中添加醇,并且使醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸
烷基酷。本发明还提供了ー种使用有产油能力且包含脂酶编码基因的微生物来生产脂肪酸甲酯的方法,该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力且包含脂酶编码基因的微生物以生产油;(b)诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸;以及(c)向所生产的游离脂肪酸中添加甲醇,并且使甲醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸甲酷。本发明的其他特征和实施例在下文的详细说明和附加权利要求中显而易见。
图1示出用不透明红球菌(Rhodococcusopacus)PD630从典型油(甘油三酯TAG)高效生产脂肪酸甲酯的方法。图2示出重组载体rpR0UC18(a)和rpR0UC18_KM(b)的遗传图谱。图
3示出包含sdpl和MSMEG_0220基因的重组载体pRUCSdpMag的遗传图谱。图4示出基于表1所示的信息得到的质粒的类型和信息。图5示出游离脂肪酸的气相色谱分析結果。图6和7示出脂肪酸甲酯的气相色谱分析結果。
具体实施例方式除非另行定义,否则在此使用的所有技术和科学术语的含义与本领域技术人员所通常理解的相同。在此使用的命名法和实验方法是本领域众所周知并且经常使用的。发明详述中的主要术语的定义如下。如在此使用,术语"油"是指ー种能量载体,当微生物富有碳源而缺乏其它生长因子(氮、磷、氧、硫、等等)吋,其可在微生物細胞内合成并积累。它是ー种游离脂肪酸前体,可水解为游离脂肪酸和甘油。如在此使用,术语"脂肪酸"指饱和或者不饱和的单羧酸类型的链。这些脂肪酸根据碳链长度和饱和度进行分类,油(即,脂肪)水解而产生的脂肪酸被称为"游离脂肪酸〃。一方面,本发明涉及ー种使用有产油能力的微生物生产脂肪酸烷基酯的方法,尤其涉及ー种生产脂肪酸烷基酯的方法,该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力的微生物以生产油;
(b)诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸;并且(c)向所生产的游离脂肪酸中添加醇,并且使醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸
烷基酷。在本发明中,油可以是微生物生产的任何油,其实例包括但不限干,甘油三酯(TAG)、ニ酰甘油(DAG)、单酰甘油
(MAG)、磷脂、留醇类脂、鞘脂类、糖脂、异戊烯醇类脂以及聚***化合物。在此,通过分解油而产生的游离脂肪酸可以是饱和或者不饱和脂肪酸,其中不饱和脂肪酸指具有一个或多个碳链内双键的脂肪酸,其实例包括油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、蓖麻油酸、1ト十八碳烯酸、顺9-二十碳烯酸、花生四烯酸、EPA(5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、芥子酸、DHM4,7,10,13,16,19-二十ニ碳六烯酸)等。另外,饱和脂肪酸指没有碳链内双键的脂肪酸,其实例包括丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、正廿ニ烷酸、二十四(烷)酸等。用于本发明的脂肪酸可被选自下述基团的取代基取代,包括但不限于芳环基、环氧基、***基基团和卤素基团。在本发明中,作为游离脂肪酸的前体的油是由有产油能力的微生物生产的。有产油能力的微生物包括气单胞菌属(Aeromonassp.)、无色杆菌(AchromcAactersp.)、德氏食酸菌(Acidovoraxdelafieldii)、敏捷食酸菌(Acidovaxfacilis)、不动细菌属(Acinetobacter8卩.)、放线菌ノ禺(Actinomyces8卩.)、气单胞|6|)||(Aeromonassp·)、产碱杆菌属(Alcaligenessp.)、父替单胞菌属(Alteromonassp.、破囊壶菌属(Althorniasp.)>Aplanochytriumsp.>
%M)(Aspergillussp·)、ロ变杆菌偶(Amoeoobactersp·)、隐球蓝细菌属(Aphanocapsasp.)、隐杆蓝细菌属
(Aphanothecesp.)、自养水螺菌(Aquaspirillumautotrophicumノ、差瘤固風t艮瘤菌(Azorhizobiumcaulinodansノ、固氣螺菌偶(Azospirillumsp.)>1!)(Azospirillumsp·)、杆困)Ii(Bacillussp·)、贝日阿托菌属(Beggiatoasp.)、贝氏固風菌属(Beijerinckiasp.)、贝内克菌属(Beneckeasp.)、布拉霉属(Blakesleasp.)、百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum;>IfSlIIfeH(Caryophanonlatum)、禾内不十菌属(Caulobactersp.)、绿胶蓝细菌(Chlorogloeasp.)、紫色硫光合细菌(Chromatiumsp.)、色杆菌属(Chromobacteriumsp.)、梭状芽胞杆囷(Clostridiumsp.)、,女氧化细菌(Comamonas8ロ.)、棒状杆固ノ禺(Corynebacteriumsp.)、β急甲藻(Crypthecodinium8ロ.)、蓝ダ桌细菌属(Cyanobacteriasp·)、德克斯氏菌属(Derxia8レ.)、脱硫线菌属(、月兄ij/liii求lif(Desulfosarcinavariabilis)(Desulfovibriosapovorans)>夕卜硫多エ!&系菌属(Ectothiornodospirasp.)>ElinalSTM^iiiimiftiil(Entomophthorasp.)、氧化铁杆囷(Ferrobacillusferroxidans)、黄杆囷偶(Flavobacteriumsp·)、流感嗜血杆囷ill(Haemophilusinfluenzaeノ、盐杆Mノ属
(HaloDacteriumsp.)>BiiSilii(Haloferaxmediterranei)、网姨藻(Hydroclathratusclathratus)、敏捷風细1(Hydrogenomonasfacilis)、氢噬胞菌属(Hydrogenophagasp.)、生丝微菌属(Hyphomicrobiumsp.)、德氏泥ホ干1、丄lyobacterdelaiielan)>JaponochytriumMj||>Labrysmonachus、Lamprocystisroseopersicma>Lampropediahyalina>-%03^f|Sfj||(Legionellasp.)>Leptotnrixdiscophorus、***f十菌属(Methylobacteriumsp.)、甲烧'氧化菌属(Methylosinussp.)、细球菌属(、被孢%属(Mortierellasp·)、分支杆菌属(Mycobacteriumsp.)、冃化杆困鳥(Nitrobactersp.)、1卡菌ノ禹(Nocardiasp.)、Paracoccusdentrificans、^^__(Oscillatorialimosa)、105*%(PeniciIliumcyciopium)、良光细囷)(Photobacteriumsp.)、Physarumploycephalum、乡贝%属(Phycomycessp.)、假Ifi^M(Pseudomonassp.;λ^^ΧΜΜΜ(Pythiumsp.)(、
根溜菌厲(Rhizobiumsp.)、Rhodobacillus菌属、红细囷属(Rhodobactersp.)、红球菌属(、红对ヽ菌ノ禹(Rhodocyclussp.)、yj尼fc红微困(Rhodomicrobiumvannielii)、红イfe单胞■ノ禺(Rhodopseuaomonassp.)、红虫系菌ノ禹(Rhodospirillumsp.)
、裂殖壶菌属(Schizochytriumsp.)、少动鞘氨酉学单胞菌(Sphingomonaspaucimobilisハ螺鹵ノ禹(、螺方足藻属(Spirulinasp.)、葡萄球菌ノ禹(Staphylococcussp.)、斯特拉菌属(Stellasp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)、沃氏互养单胞菌(Syntrophomonaswolfei)、嗜热监*细M(Thermophiliccyanobacteria)、栖热M(Thermusthermophilus)、噬硫杆菌A2(ThiobacillusA2)、噬硫杆菌属(Thiobacillussp.)、荚硫囷晨(Thiocapsasp.)、海件破襄Se囷属(Thraustochytriumsp.)、硫襄菌(Thiocystisviolacea)、優5瓜囷(Vibrioparahaemolyticus)、自养喊色杆M(Xanthobacterautotrophicus)、唾麦芽黄单胞菌(Xanthomonasmaltophilia)、菌月父团(Zoogloeasp.)以及转化有有产油能力的酶编码基因的微生物。另外,显然任何能产油的微生物都可用于本发明的方法。在本发明中,步骤(a)中的培养可包括用于微生物生长的第一步培养和用于产油的第二步培养,其中,用于产油的培养优选在含有限制氮源的培养基中进行以提高油的产里。微生物生产的油是在微生物里自溶,且步骤(b)中的自溶可由脂酶进行。脂酶的实例包括甘油三酯脂酶(,)、单酰甘油脂酶(EC:)以及溶血磷脂酶()。优选地,编码脂酶的基因可被导入有产油能力的微生物中或者或在该微生物中进行扩增。更优选,可将通过与底物反应而被激活的脂酶基因导入微生物中。在本发明的一个实施例中,为了使微生物中的油自溶,使用导入有
SEQIDNOS:5和8的脂酶基因的微生物菌株。在另ー个实施例中,使用单独导入有SEQIDN0S:17、18和19的甘油三酯脂酶基因,或者单独导入SEQIDNO:20的单酰甘油脂酶,或者导入它们的组合的微生物菌株。在本发明中,步骤(C)中添加的醇可以是伯醇、仲醇或者叔醇。优选地,可使用具有1到8个碳原子的醇或者两种或更多种具有1到8个碳原子的醇的混合物。更优选,可使用甲醇。另外,步骤(c)的反应可在80_120°C进行小吋。此外,步骤(C)的反应可在有机溶剂,优选***仿存在的情况下进行。在本发明的一个实施例中,使用不透明红球菌(Iihodococcusopacus)PD630作为有产油能力的微生物,而且执行由用于微生物細胞生长的第一步培养和用于产油的第二步培养的两步培养方法。在用于产油的第二步微生物培养中,采用限制氮源的培养基以诱导产油。对于所产油的自溶,将可被乙酰***激活的脂酶基因导入微生物菌株中,并且使用通过向微生物中加入乙酰***。另外,将所获得的游离脂肪酸溶液冻干以去除水分,然后向其中加入***仿和含有H2SO4的甲醇,并在100°C反应12个小吋。然后向其中加入水,分离有机溶剂层,从而获得游离脂肪酸甲酷。所生产的游离脂肪酸甲酯的浓度是
,表明游离脂肪酸已经转变为游离脂肪酸甲酷(图1)。这证明使用本发明的方法可更容易、环保且高效地生产脂肪酸甲酷,表明本发明方法对于生产生物柴油(轻油或类似物的代用品)非常有用。另ー方面,本发明涉及ー种使用有产油能力且包含脂酶编码基因的微生物生产脂肪酸甲酯的方法,该方法包括以下步骤(a)培养有产油能力且包含脂酶编码基因的微生物以生产油;(b)通过脂酶诱导微生物内产生的油自溶以生产游离脂肪酸;以及(c)向所生产的游离脂肪酸中添加甲醇,并且使甲醇与游离脂肪酸反应以生产脂肪酸甲酷。在本发明的另ー个实施例中,使用单独导入有甘油三酯脂酶基因或单独导入有单酰甘油脂酶基因或导入它们的组合的微生物菌株,然后可见,与导入甘油三酯脂酶基因或单酰甘油脂酶基因相比,当甘油三酯脂酶基因与单酰甘油脂酶基因被一起导入微生物菌株吋,相同量的葡萄糖可产生更多的游离脂肪酸,因而,当甘油三酯脂酶基因与单酰甘油脂酶基因被一起导入吋,脂肪酸甲酯的生产更为高效。因此,本发明优选将甘油三酯脂酶基因与单酰甘油脂酶基因一起导入微生物菌株中。同吋,本发明的下述例子只是阐明具体的培养基和培养方法。使用糖解液如乳清或者CSL(玉米浆)以及其它培养基,以及使用各种培养方法如流加培养或者连续培养,如又献(Leeetal.,.,2663,2003;Leeetal·