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使用抗氧化剂的组合增强陪伴动物免疫反应的方法和产品的制作方法.docx

上传人:开心果 2023/3/13 文件大小:32 KB

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专利名称:使用抗氧化剂的组合增强陪伴动物免疫反应的方法和产品的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种用于增强陪伴动物(如狗)的免疫反应和提高其总体健康状况的方法和产品,更明确地说,涉及一种于动物饮食中提供有益量的抗氧化剂的方法和产品。
近年来,抗氧化剂的保健作用引起了人们越来越多的兴趣。抗氧化剂是可对抗活性氧类(也公知为自由基)作用的营养物。这些有害分子是正常代谢的副产物。抗氧化剂营养物通过附着至这些分子、中和它们并将它们从身体内清除来对抗自由基的作用。自由基的低效清除牵涉到对人体造成损伤,据信其可导致某些疾病如阿尔茨海默病、自身免疫病、肿瘤、心血管疾病、白内障、糖尿病、斑点退化、多发性硬化症、肌营养不良、胰腺炎、帕金森病以及类风湿性关节炎。由于这些自由基的累积而引起的损伤可能是老化过程的原因,这些自由基随着时间推移而累积,引起随衰老而发生的免疫反应抑制,导致老年人群中渐增的发病趋势。
抗氧化剂营养物是对一些化合物的一种分类,其中所述化合物具有相似的中和有害自由基的作用。它们包括公知的维生素如维生素A、维生素C和维生素E。它们也包括其它分类为类胡萝卜素的化合物。类胡萝卜素的实例包括
β-胡萝卜素、黄体素、虾青素、角黄素和番茄红素。这些化合物是形成水果、花和蔬菜中的绿色、黄色、橙色和粉红色色素的原因。这些类胡萝卜素公知对免疫系统的调节起重要作用(例如,已发现类胡萝卜素可防止小鼠中化学诱导的致癌作用以及增加大鼠淋巴细胞增殖)。已发现虾青素和β-胡萝卜素可增加小鼠脾细胞针对T-依赖性抗原的离体抗体反应。已发现饮食性黄体素可增强小鼠脾细胞的淋巴细胞增殖。
虽然这些化合物全部分类为抗氧化剂,但有一点已逐渐明显,即它们并不以同样的方式发挥作用。例如,以前对人进行的研究表明,摄食高抗氧化剂之饮食(即水果和蔬菜的高摄入)的群体较其它人群组比较,前者具有较低的肿瘤发病率。然而提供补加抗氧化剂(如单一的维生素E或β-胡萝卜素)的临床研究表明它们不提供同等的保护。目前认为受益于抗氧化剂营养物的人类之健康可通过一些不同的抗氧化剂的低水平组合实现,而非高水平的单一抗氧化剂。
虽然狗还没有进化为依赖基于大量水果和蔬菜的饮食,但它确实搜寻并吃小的食植动物,后者消费具有高浓度此类化合物的植物。因此,可能狗对抗氧化剂的需要是自然地进化的。据此,在本领域中,需要在陪伴动物(如狗)的饮食中提供有益的抗氧化剂,以提供保健作用。
本发明提供了一种饲喂陪伴动物(如狗)饮食的方法,其中饮食包含有效量的抗氧化剂的组合,以增强动物的免疫反应和提高动物的总体健康状况。优选地,饲喂动物一种饮食,其包括维生素
E、黄体素和β-胡萝卜素的组合。该抗氧化剂包为动物提供了从约175至约400IU的维生素E/千克饮食、从约1至约50mg/天的黄体素、以及从约1至约50mg/天的β-胡萝卜素。已发现此类饮食可优化狗的免疫细胞以及增加狗的疫苗识别。
因此,本发明的一个特点是通过在动物饮食中提供有效量的抗氧化剂的组合,来提供增强陪伴动物(如狗)的免疫反应和提高其总体健康状况的一种宠物食品和方法。通过下列详述、附图和附加的权利要求,本发明的这个和其它特点和优点将变得显而易见。
图1是狗的抗体浓度(mg/dl)对mg/kg饮食中的β-胡萝卜素作图。
图2是阐明饮食性黄体素对狗疫苗识别之影响的作图。
本发明提供了一种饲喂陪伴动物(如狗)饮食的方法,其中饮食包含有效量的抗氧化剂的组合,以增强动物的免疫反应和提高动物的总体健康状况。该抗氧化剂的组合可作为补充物或包含在饲喂动物的饮食中提供给动物。此补充物可为丸剂或胶囊剂形式、糖果(treat)或饼干、或任一其它可食用的形式。“饮食”是指被动物有规律地摄入的食物或饮料。通过使用抗氧化剂的组合,认为可对免疫系统的许多方面提供保健作用,例如,优化的免疫细胞激活、抗体水
平的增加、以及抗体识别的提高。
饮食可为任一合适的宠物食品配方,该配方也可为动物提供足够的营养物。例如,本发明使用的一般狗食可包含约18-40%粗蛋白、约4-30%脂肪、以及约4-20%总饮食性纤维。但这些或其它营养物不要求特定比率或百分比。抗氧化剂的组合可与此类饮食混合,以提供所需要的有益的数量。
为了使本发明更易于理解,可参照以下实施例,其用于阐明本发明,而不用于限制发明范围。
为了研究给予单剂口服β-胡萝卜素的狗对口服β-胡萝卜素的摄入,狗(n=6只/处理)一次性经口给予0、50、100或200mgβ-胡萝卜素(10%冷水溶解;BASFCorp.,Ludwigshafen,德国)。合适剂量的β-胡萝卜素溶于5ml水,其通过饲喂注射器口服饲喂。为建立合适的取样时间,用两只狗进行了初步研究。对这些狗一次饲喂50mg的β-胡萝卜素,并于0(恰好在饲喂β-胡萝卜素前)、3、6、9、12、15、18、21和24小时抽取血样。
通过离心分离血浆,并用高效液相层析(HPLC)如下分析β-胡萝卜素浓度。所有步骤在暗光下进行。在BHT存在下,用1∶1的二***和石油醚混合物对双份血浆、每份白细胞匀浆和每份白细胞的亚细胞级分进行提取。移去醚相并于流动氮下干燥。在流动相中重建残余物,用于β-胡萝卜素的HPLC
测定。将样品(50μl)注入5μm球形C-18反相柱(×150mm;Resolve),并且用47∶47∶6(v/v/v)的乙***、甲醇和***。
这个实施例的结果显示β-胡萝卜素的峰浓度在给予剂量后3至6小时间出现,且于24小时时不可检测到。接下来,在同样的时间段从剩余狗抽取血样。同样分离血浆并通过HPLC分析。
在所有的研究时间段,未补充β-胡萝卜素的狗均不能检测到血浆β-胡萝卜素的浓度。相反对口服给予β-胡萝卜素的狗,其血浆β-胡萝卜素呈剂量依赖性升高(P<)。在给予剂量后6小时观察到峰浓度,并且在所有的处理组中是一致的。此后所有补充β-胡萝卜素之狗中β-胡萝卜素浓度快速下降(P<)。在给予剂量后24小时不可检测到浓度。血浆β-胡萝卜素的半寿期为3(50和100mg剂量)至4(100mg剂量)小时。狗的血液β-胡萝卜素的峰浓度比猫早出现(见下面的实施例4和5)。同样,在调整体重差异后狗的血浆β-胡萝卜素的浓度比在猫上观察的低约10至16倍。
在第二个研究中,狗(n=6只/处理)每天于0800点连续饲喂0、、25、50或100mgβ-胡萝卜素7天。β-胡萝卜素追加在食物中并于早餐饲喂。于0天(恰好在第一次剂量前)和接下来于施用每剂后6小时(1至7天)每天抽取血样一次。该抽取血样时间的选择是基于实施例
1得到的结果,其显示β-胡萝卜素的峰浓度位于一次剂量后6小时。分离血浆并分析β-胡萝卜素的浓度。
7天中每天施用β-胡萝卜素的狗产生剂量依赖性上升的循环β-胡萝卜素。饲喂100mgβ-胡萝卜素的狗显示出血浆β-胡萝卜素的日浓度急速上升。在这个实施例中,饲喂100mgβ-胡萝卜素的狗在第一天血浆β-胡萝卜素的峰浓度(18μg/L)类似于第一个研究中所观察到的。在最后一次剂量后血浆β-。
设计的第三个研究是用于研究狗的血淋巴细胞对β-胡萝卜素的摄入。狗(n=8只/处理)每天饲喂0、50或100mgβ-胡萝卜素30天。所有狗的血样于10、20和30天时通过颈静脉抽取。密度梯度离心分离血淋巴细胞和嗜中性粒细胞。计数细胞数。淋巴细胞和嗜中性粒细胞重悬于含有3%抗坏血酸钠(作为抗氧化剂)的PBS。等份的细胞悬液超声处理30秒以破碎细胞。提取白细胞匀浆用于β-胡萝卜素的HPLC分析。
于第30天取较大量的血,如上所述制备白细胞悬液用于接下来的亚细胞分级分离。。加入抗坏血酸钠作为抗氧化剂。离心匀浆(4℃,600×g10分钟),从上清液分离核沉淀物。离心去核后的上清液
(4℃,17,300×g20分钟)以分离线粒体级分。离心去线粒体后上清液(4℃,102,000×g60分钟),以从胞质级分分离微粒体。用HPLC分析每种亚细胞级分的β-胡萝卜素含量。
第0天(补充β-胡萝卜素前),在所有狗的外周血淋巴细胞中均不能检测到β-胡萝卜素的浓度。同样,在整个研究中未补充β-胡萝卜素的狗淋巴细胞中仍然检测不到β-胡萝卜素。相反,饲喂β-胡萝卜素的狗淋巴细胞中β-胡萝卜素浓度通常以时间-依赖性方式上升(P<)。比较饲喂50或100mgβ-胡萝卜素的狗淋巴细胞中β-胡萝卜素浓度,没有显著的处理差异。
从未补充β-胡萝卜素的狗获得的淋巴细胞之多种亚细胞级分中均不能检测到β-胡萝卜素。相反,从补充β-胡萝卜素的狗所分离的血淋巴细胞之所有亚细胞级分均摄入β-胡萝卜素。胞质级分占淋巴细胞中总β-胡萝卜素的52至62%,而核含有总β-胡萝卜素的最低量(6至8%)。线粒体(14至17%)和微粒体(16至23%)介于胞质和核之间。在饲喂的第30天,饮食性β-胡萝卜素之剂量对亚细胞级分摄入β-胡萝卜素无显著影响。该结果表明所有淋巴细胞亚细胞级分均摄入β-胡萝卜素。但胞质中β-胡萝卜素最高。
与淋巴细胞一样,血嗜中性粒细胞同样摄入β-胡萝卜素。但与淋巴细胞不同的是其最大摄入发生在第10天,且在第
30天观察时嗜中性粒细胞β-胡萝卜素的浓度无进一步的上升。血嗜中性粒细胞的胞质、线粒体和微粒体也显示明显的β-胡萝卜素的摄入。相反,核中未检测到β-胡萝卜素。与血淋巴细胞亚细胞级分一样,血嗜中性粒细胞的胞质级分中β-胡萝卜素最高(61至68)。没有观察到明显的剂量效应。
在第四个研究中,雌性小猎兔犬(4至5月龄)每日补充0、25、50或100mgβ-胡萝卜素,以研究饮食性β-胡萝卜素在加强狗细胞介导的免疫和体液免疫系统中的作用。评估所有动物或外周血淋巴细胞中的下列参数(1)针对PHA(非特异性免疫)和疫苗(特异性免疫)的迟发型超敏反应(DTH),(2)淋巴细胞增殖,(3)淋巴细胞群以及(4)免疫球蛋白(Ig)。
补充β-胡萝卜素可以剂量依赖性方式使血浆β-胡萝卜素浓度上升,但不影响血浆视黄醇或α-生育酚。这些改变通常反映对特异的(疫苗)和非特异的(PHA)抗原之DTH应答。饲喂50mgβ-胡萝卜素的狗可观察到对PHA攻击的最大反应,而饲喂20或50mgβ-胡萝卜素的狗显示对疫苗明显较高的DTH反应。迟发型超敏反应是严格地细胞反应,其涉及T细胞和巨噬细胞而不涉及抗体成分。抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)呈递抗原或变应原至T细胞,使T细胞活化并释放淋巴因子。这些淋巴因子活化巨噬细胞并使它们变为外来入侵者的贪婪杀手。因此该数据显示饲喂β-胡萝卜素的狗具有增高的细胞介导的反应。
β-胡萝卜素饲喂也对淋巴细胞亚群产生明显的改变。与对照比较,饲喂20或50mgβ-胡萝卜素的狗具有增多的CD4+细胞(第8周)。饲喂20mgβ-胡萝卜素的狗在第2和4周也具有增多的CD8细胞。T细胞可根据CD4膜分子的表达分类。CD4作为粘附分子和作为共信号传递的共受体发挥作用。它在T细胞活化中起作用。CD4+T淋巴细胞识别与II类MHC分子结合的抗原并且主要作为辅助细胞起作用。对饲喂20至50mgβ-胡萝卜素的狗,本研究的T辅助细胞群之增多可以解释相应的DTH反应之增强。
早至规定饮食补充后一周,饲喂β-胡萝卜素的狗之IgG、IgM和总IgG的浓度明显增高。饲喂0至20mgβ-胡萝卜素的狗其Ig的增高呈剂量依赖。β-胡萝卜素的最高水平(50mg)不产生进一步的增加。饲喂20mgβ-胡萝卜素的狗一直对两类Ig具有最大的抗体反应。免疫系统的主要功能之一是产生抗体,其自由地循环以保护机体抵御外来物质。抗体起到中和***、固定某些微生物、中和病毒活性、凝集微生物或抗原颗粒以及沉淀可溶抗原的作用。
β-胡萝卜素饲喂不影响促分裂原诱导的淋巴细胞母细胞化和IL-2产生。淋巴细胞参与细胞介导的免疫。识别抗原后,淋巴细胞很快分裂,以此克隆自身以备与潜在入侵争斗。在体液免疫反应中,IL-2刺激与抗原反应的T辅助细胞和B细胞增殖。抗原或促分裂原活化的T细胞的克隆扩增需要它。在细胞介导的免疫反应中,
IL-2活化天然杀伤细胞、刺激胸腺细胞增殖以及诱导细胞毒T细胞活性。
基于这些实验结果,狗从饮食中吸收了显著量的β-胡萝卜素并将β-胡萝卜素转运至免疫细胞和巨噬细胞的亚细胞器。在这些细胞中β-胡萝卜素看来是通过增强细胞介导的免疫反应(DTH反应、淋巴细胞亚群漂移)和体液反应(IgG和IgM产生)来增强狗的免疫系统。黄体素56只雌性小猎兔犬(年龄17至18个月;±)随机地每日补充0、5、10或20mg黄体素,共17周。%%玉米黄质。将黄体素补充物重悬于大豆油至合适的浓度,并于每天0800时经口施与1ml。在该黄体素补充物后立即提供食物(200g/狗/天)。基础饮食满足或超过对所有必需营养物的需求(NRC1985)。所有狗置于2×2m围栏内(2只狗/围栏),置于有温度(20至22℃)及光照(14hr光)控制设施的环境中。在第0、6和12周时记录体重。
第0、2、4、8和12周时,通过颈静脉穿刺将血收集至肝素化的空试管,并将等份用于HPLC分析和评估免疫反应。提取和HPLC分析提取血浆用于分析黄体素、玉米黄质、视黄醇和α-生育酚。简言之,%丁基化羟甲苯(BHT)(AldrichChemicalCo.,Milwaukee,WI)的乙醇沉淀血浆蛋白质。该混合物用5ml1∶1的石油醚∶无水***混合物提取。