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使用侵染性dna的核酸酶变色传感器的制作方法.docx

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使用侵染性dna的核酸酶变色传感器的制作方法.docx

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专利名称::-01-ER63179、NSFCTS-0120978和NSFDMR-0117792。美国政府可对本发明拥有权利。
背景技术:
:检测样品中分析物存在与否的能力具有重要意义。例如,当许多金属和金属离子,例如铅、***、镉、铬、***等存在于饮用供水系统中时,会对健康造成严重威胁。为了防止饮用供水系统和其它供水系统受到污染,在将工业废水(waste-streams)排放到水处理厂之前,通常要对其进行检测。在生物流体(例如血液以及来自体组织的体液)中测定多种分析物,以确定机体是否暴露于有害物或者是否处于疾病状态。例如,近来需要在各种样品中测定痕量的炭疸菌以及其它生物学的有害物。比色法通常用于检测土壤、水、废水、生物样品、体液等中的金属和离子。与基于仪器的分析方法,例如原子吸收光谱法相比,比色法快速,并对设备或使用者的精通程度几乎没有要求。例如,水族馆管理人员可以利用当加入含有浓度增加的***盐离子(N03—)的水样时变为暗粉色的比色试验。以此方式,比色试验显示样品中存在待测分析物如***盐,同时通过所产生的特殊色度指示样品中分析物的量。虽然比色试验十分有用,但其仅能应用于有限的分析物,且经常不能检测到非常少量或痕量的分析物,并且根据样品的性质,产生假阳性或假阴性结果的水平无法接受。当不存在分析物时,比色试剂产生与存在分析物相关的颜色,因而产生假阳性;
而当待测分析物存在于样品中却并没有产生期望的颜色时,产生假阴性。假阳性通常由样品中那些不能通过比色试验将其与待测分析物相区分的组分引起。假阴性通常由样品中那些干扰产生分析物相关颜色的化学反应的组分引起。从上面的描述可以看出,需要开发可以识别更宽范围的痕量分析物的比色试验。此外,假阳性和/或假阴性结果发生率较低的比色试验具有重要意义
发明内容本发明的一个方面在于公开了一种传感器系统,其包括核酸酶、核酸酶的底物、第一颗粒以及侵染性DNA。所述底物可以包括第一多核苷酸,所述第一颗粒可以包括与第一颗粒偶联的第二多核苷酸。所述侵染性DNA可以包括第四多核苷酸。第一多核苷酸可至少部分互补于第二和第四多核苷酸。所述传感器系统还可以包括第二颗粒,该第二颗粒包括至少部分互补于第一多核苷酸的第三多核苷酸。本发明的另一方面在于公开了一种检测分析物的方法,该方法包括将聚集体、样品和侵染性DNA合并,检测对分析物响应产生的颜色变化。所述聚集体可以包括底物和第一颗粒。所述聚集体还可以包括第二颗粒和核酸内切酶。本发明的再一方面在于公开了一种测定分析物的试剂盒,该试剂盒包括含有聚集体形成系统的第一容器,该聚集体形成系统包括第一多核苷酸和第一
颗粒,以及含有侵染性DNA的第二容器。为了清楚一致地理解说明书和权利要求书,提供以下定义。术语"样品"或"试验样品"定义为待分析的、可能含有待测分析物的组合物。一般而言,用于分析的样品为液体形式,优选的样品为水性混合物。样品可来自任意来源,例如来自废水的工业样品或者生物样品,例如血液、尿或唾液。可以是工业样品或生物样品的衍生物,例如提取物、稀释物、滤液或再生沉淀。术语"分析物"定义为可能存在于样品中的一种或多种物质。分析方法确定样品中分析物的存在、量或浓度。术语"比色分析"定义为一种分析方法,其中当分析物存在或不存在时,组成传感器系统的一种或多种试剂产生颜色变化。术语"灵敏度"是指传感器系统可以测定分析物的浓度下限。也就是说,传感器系统对分析物越灵敏,系统对低浓度分析物的测定越好。术语"选择性"是指在其它物质存在时,该传感器系统测定目标分析物的能力。术语"杂交"是指在低严格条件下,第一多核苷酸与至少一个第二核苷酸形成至少一个氢键的能力。参考如下附图和描述可以更好地理解本发明。附图中的组分不是衡量和意图准确地表示分子或其相互作用,而重在强调其对本发明原理的解释。图1表示测定样品中分析物存在及其任意浓度的比色分析方法。图2A表示依靠
Pb(II)作为辅因子以显示催化活性的DNA酶。图2B表示DNA酶对DNA底物的剪切。图3A表示Pb(II)分析物和侵染性DNA存在时,聚集体的解聚。图3B表示使用寡核苷酸功能化颗粒对DNA底物进行尾-尾杂交。图3C表示使用寡核苷酸功能化颗粒对DNA底物进行头-尾杂交。图4为由聚集的(实线)和解聚的(虚线)金纳米颗粒从样品发出的光的波长相对于消光度比的曲线图。图5A表示含有侵染性DNA(Inva)和Pb(II)(o)的样品、含有侵染性DNA(Inva)但不含Pb(II)(▲)的样品,以及含有Pb(II)但不含侵染性DNA(■)的对照样品的消光度比随时间的变化图。图5B表示含有侵染性DNA(Inva-A)和Pb(II)(o)的样品、含有侵染性DNA(Inva-A)但不含Pb(II)(A)的样品,以及含有Pb(II)但不含侵染性DNA(■)的对照样品的消光度比随时间的变化图。图6A为含有和不含有Pb(II)分析物时,每种变短的(相对于原始Inva链)优选侵染性DNA链的消光度比变化作为时间函数的图。图6B为含有和不含有Pb(II)分析物时,每种变短的(相对于原始Inva链)替代侵染性DNA链的消光度比变化作为时间函数的图。图7A表示多种金属阳离子在522nm和700nm的消光度比作为时间函数的图。图7B表示5分钟后由传感器系统的颜色变化观察到的消光度比与Pb(II)分析物浓度之间的相关性图。图7C表示IO分钟内,Inva-6对多种浓度的Pb(II)分析物的消光度比图。图8表示金纳米颗粒聚集体依赖于
NaCl的稳定性图。图9为DNA酶组装的13mm金纳米颗粒聚集体的TEM图像照片。图10A-10S表示使用特定分析物作为催化剪切反应的辅因子的核酸酶。具体说明在相关申请中,2002年5月10日提交的名称为"SimplecatalyticDNAbiosensorsforionsbasedoncolorchanges",679公开了一种比色传感器,其一方面通过加热加速分析物催化的聚集体解聚。该在先的传感器系统中,将样品加入DNA酶/底物/颗粒聚集体中。如果样品含有选择的分析物,则将该混合物加热以引起聚集体的解聚。本发明者发现将侵染性DNA加入DNA-RNA酶/底物/颗粒聚集体,不经加热即可加速聚集体的解聚。由此提供了一种变色(light-up)比色传感器,其在室温下对选择的分析物产生响应,发生期望的颜色变化,,679公开的传感器系统的缺点。图1表示在样品102(未示出)中测定分析物105的存在及其任意浓度的比色分析方法100。在110中,选择分析物105,使用方法100测定其存在/浓度。一方面,如下文进一步讨论的,该分析物105可以是如下所述的可用作剪切反应辅因子的任意离子。优选的具有+l形式氧化态(I)的一价金属离子,包括Li(I)、Tl(I)和Ag(I);优选的具有+2形式氧化态(II)的二价金属离子,包括Mg(II)、Ca(II)、Mn(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Cd(II)、Cu(II)、Pb(II)、Hg(II)、Pt(II)、
Ra(II)、Sr(II)、Ni(II)和Ba(II);优选的具有+3(III)、+4(IV)、+5(V)的三价和更髙价形式氧化态的金属离子,包括Co(III)、Cr(III)、Ce(IV)、As(V)、U(VI)、Cr(VI)和镧系元素离子。考虑到对生物体的毒性,更优选的分析物离子包括Ag(I)、Pb(II)、Hg(II)、U(VI)和Cr(VI)。目前特别优选的分析物离子是Pb(II)。在110中,一旦选择了分析物105,就可以在120中进行定向进化122以分离核酸酶,例如DNA酶124或RNA酶126,当存在分析物时,这些酶将催化底物的剪切。该定向进化122优选体外类型的筛选方法,该方法根据其与其它组分的作用能力选择分子。因此当存在分析物105时,可以选择定向进化122的步骤以获得显示增强的底物剪切的DNA-RNA酶(由此获得传感器的灵敏度)。还可以选择该步骤,以排除那些当存在选择的分析物时显示剪切、但当样品102中存在未选择的分析物和/或其它物质时也显示剪切的DNA-RNA酶(由此获得传感器的选择性)。所述定向进化122可以选择任意的筛选途径,当存在目标分析物时,获得以期望的灵敏度和选择性催化底物剪切的核酸酶。一方面,所述定向进化122可以用DNA库启动,该DNA库包括大量链(例如1016种序列变异体),每条链都具有不同的碱基变异。可使用亚磷酰***化学法产生这些链。然后筛选该DNA库以得到与分析物结合的链。分离并通过例如PCR扩增这些链。随后将扩增的链进行突变以再引入变异,然后筛选得到与分析物更有效结合的链。经过反复筛选、扩增和突变序列,同时提高筛
选需要的有效结合量,产生更有效结合分析物并由此获得更高灵敏度的链。一方面,可以利用称为体外筛选和进化的技术进行定向进化122。关于该技术的细节可以在Breaker,.,Joyce,.,"ADNAenzymewithMg2+-dependentRNAphosphoesteraseactivity",,2:655-660;以及JingLi等,"InVitroSelectionandCharacterizationofaHighlyEfficientZn(II)-dependentRNA-cleavingDeoxyribozyme",jVwc/e/cv4c油紋28,481-488(2000)中获得。另一方面,可以通过在定向进化122中引入负选择方法得到对特定分析物具有更高选择性的核酸酶。筛选对分析物具有更高灵敏度的链后,再进行类似的筛选、扩增和突变序列,除选择的分析物之外,所得链必须不与相关分析物紧密结合。例如,可以选择对Pb(n)特异结合,但对Mg(n)、Ca(ii)、Co(II)或其它竞争性金属离子不显著结合的DNA酶。一方面,可以通过分离与Pb(II)结合的DNA酶,然后除去与Mg(II)、Ca(II)或Co(II)结合的任意DNA酶来实现。另一方面,首先弃去与Mg(II)、Ca(II)或Co(II)结合的DNA酶,然后分离与Pb(II)结合的那些DNA酶。以此方式,可以提高所述DNA酶的选择性。关于提高DNA酶选择性的方法的细节可以在Bmesehoff,P丄等,"ImprovingMetalIonSpecificityDuring/"F/加
SelectionofCatalyticDNA",Com6/wa/o〃WC7z謹&^y//妙772rowg/^w"creem>7g,5,327-355(2002)中获得。所述DNA-RNA酶124、126是当存在辅因子时,对化学反应,例如水解剪切具有催化能力的核酸酶。DNA酶124含有脱氧核糖核苷酸,而RNA酶126含有核糖核苷酸。形成DNA-RNA酶124、126的核苷酸可以是天然的、非天然的或修饰的核酸。也可以使用包括聚酰***骨架和核苷碱基的肽核酸(PNAs)(例如获自Biosearch,Inc.,Bedford,MA)。下表列出了特定分析物,可以获得使用分析物作为剪切辅因子的相应的核酸酶序列图,并记载了每种核酸酶序列的文献。图10A-10D和图10G表示对+2形式氧化态的金属离子具有特异性的反式作用核酸酶。图10K-10L表示也可作为适宜核酸酶的反式作用核酸酶。图10E-10F和图10H-10J表示对+2形式氧化态的金属离子具有特异性的顺式作用核酸酶。图IOM-IOS表示也可作为适宜核酸酶的顺式作用核酸酶。优选地,可以将顺式作用核酸酶切为两条链(截短的),例如通过剪切10M-10Q酶的右侧存在的GAAA环,以得到催化系统。可改变任意这些以及其它的核酸序列而用作DNA-RNA酶124、126。图2A将进一步讨论反式作用酶和顺式作用酶。分析物核酸酶图号(SEQIDNO)文献tableseeoriginaldocumentpage15表1:LOQ和分析测定原理tableseeoriginaldocumentpage23i:
(亚磷酸)改进原因*取消提纯和衍生步骤,*改变分析和检测方式,*//:溶解度三乙膦酸铝AEF053616三(乙基膦酸)铝C6H18A109P3o_II"iCH3—CH2—0——P——OA]/mol水120g/L(20。C)乙***5mg/L(20°C)当DNA酶和RNA酶都能与DNA底物,例如下面讨论的底物134形成双螺旋时,RNA酶/底物双螺旋不如DNA酶/底物双螺旋稳定。此外,相对于其RNA酶配对体,DNA酶更易于合成且更稳定。DNA酶124的脱氧核糖核苷酸和互补底物链134可以用其相应的核糖核苷酸代替,由此得到RNA酶126。例如,可以用胞嘧啶代替一个或多个核糖胞嘧啶,可以用鸟嘌呤代替一个或多个核糖鸟嘌呤,可以用腺苷代替一个或多个核糖腺苷,以及可以用胸腺嘧啶代替一个或多个尿嘧啶。以此方式,含有DNA碱基、RNA碱基或同时含有二者的核酸酶可以独立地与含有DNA碱基、RNA碱基或二者的互补底物链杂交。在120中筛选出合适的一个或多个核酸酶后,在130中可以形成聚集体132。该聚集体132包括核酸酶、底物134以及寡核苷酸功能化颗粒136。考虑到其组分的物理尺寸,该聚集体132可以很大。事实上,透射电子显微镜
(TEM)研究表明单个聚集体可以为100nm-l^m,并且可以聚集形成更大的结构。当存在分析物105时,底物134可以是与核酸酶杂交并被其剪切的任意寡核苷酸。该寡核苷酸可以用剪切物修饰,使底物被核酸酶剪切为两个片段。一方面,底物134是核酸酶的互补链,可以被延伸形成突出于每一端的12-mer,以与寡核苷酸功能化颗粒136杂交。例如,如果寡核苷酸功能化颗粒具有5'-CACGAGTTGACA的碱基序列,底物的适宜的突出端序列为3'-GTGCTCAACTGT。因为颗粒136显示距离依赖性的光学性质,当颗粒与聚集体132紧密结合时,该颗粒为一种颜色,并随着颗粒之间距离的增大,发生颜色变化。例如当颗粒136为金纳米颗粒时,聚集体132在水性溶液中显示蓝色,当发生解聚时则变为红色。当与功能化颗粒136结合在一起的底物134被剪切时发生解聚,从而使颗粒从聚集体132上分离。因此,当颗粒136从聚集体132扩散开时,溶液从蓝色变为红色。颗粒136可以是具有距离依赖性光学性质并与传感器系统的操作相适应的任意物质。适宜的颗粒可以包括金属,例如金、银、铜和销;半导体,例如CdSe、CdS和镀有ZnS的CdS或CdSe;以及磁性胶体材料,例如在Josephson,Lee等,AngewandteChemie,InternationalEdition(2001),40(17),3204-3206中描述的物质。特别有用的颗粒可以包括ZnS、ZnO、Ti02、Agl、AgBr、Hgl2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、