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专利名称:使用了微生物的α-羟基酸的制备方法及新颖的微生物的制作方法
技术领域:
本发明涉及利用微生物水解α-羟基***以制备α-羟基酸的方法。α-羟基酸中,乳酸对食品、酿造、工业很有用,2-羟基-4-***硫代丁酸作为家畜的饲料添加剂很有用。
背景技术:
作为利用微生物由o-羟基***[Ⅰ]制备α-羟基酸[Ⅱ]的方法,举例如下(1)利用芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、小球菌属和短杆菌属的微生物制备乳酸、乙醇酸等的方法(日本专利公报昭58-15120号);(2)利用属于棒状杆菌属的微生物制备乳酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法(日本专利公开公报昭61-56086号);(3)利用假单胞菌属、节孢子杆菌属、曲霉属、青霉菌属、旋孢霉属和镰刀菌属的微生物制备乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-羟基苯丙酸和扁桃酸的方法的方法(日本专利公开公报昭63-222696号);(4)利用节孢子杆菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、短杆菌属、旋孢霉属、棒状杆菌属、小球菌属、诺卡式菌属、青霉菌属、假单胞菌属、镰刀菌属的微生物制备2-羟基-3,3-二***-4-丁内酯的方法(日本专利公开公报昭64-10996号);(5)利用红球菌属、假单胞菌属、节孢子杆菌属和短杆菌属的微生物制备
2-羟基异丁酸的方法(日本专利公开公报平4-40897号);(6)利用乳杆菌属、假单胞菌属、产碱菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、诺卡式菌属、红球菌属和节孢子杆菌属的微生物制备α-羟基-4-***硫代丁酸的方法(日本专利公开公报平4-40898号);(7)利用产碱菌属、红球菌属和ゴルドナ(Goldona)属的微生物制备4-***硫代丁酸的方法(WO96/09403号);(8)利用パントエア(Pantoea)属、小球菌属、无芽孢杆菌属等的微生物制备4-***硫代丁酸的方法(日本专利公开公报平8-173175号)等。
但是,这些制备α-羟基酸的方法不一定能够满足使目的产物以高浓度生成并蓄积的目的,例如,%的乳酸(日本专利公开公报昭61-56086号);利用属于假单胞菌属的微生物只能蓄积10重量%的乳酸(日本专利公开公报昭63-222696号);%的乳酸(日本专利公开公报昭63-222696号)。此外,%的α-羟基异丁酸(日本专利公开公报昭63-222696号);利用属于乳杆菌属的微生物只能蓄积188mM(%)的α-羟基-4-***硫代丁酸(日本专利公开公报平4-40898号);利用属于节孢子杆菌属的微生物只能蓄积55mM(%)的α-羟基-4-***硫代丁酸
(日本专利公开公报平4-40898号);利用属于产碱菌属的微生物只能蓄积940mM(14重量%)的α-羟基-4-***硫代丁酸(WO96/09403号)。
造成生成物蓄积浓度较低的原因是α-羟基***和水溶液中相应的醛或***被部分解离为氢***酸[化学综述(ChemicalReviews)第42卷,189页,1948年],酶活性受到氢***酸的抑制[农业生物化学(AgricalturalBiologicalChemistry)第46卷,1165页,1982年]。而且,由于解离的醛的作用有可能使酶在短时间内失活,为了解决这个问题,提出了添加酸性亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的方法(日本专利公开公报平5-192189号)、添加亚磷酸离子或次磷酸离子的方法(日本专利公开公报平7-213296号)。但是,即使使用了上述添加物,也不能够提高α-羟基酸的生成蓄积浓度。
本领域的技术人员都知道,一般生成物的蓄积浓度较低时,制备该生成物的设备都较复杂,且规模较大。所以,工业上利用上述方法制备α-羟基酸时存在制备效率较低的问题。本发明的目的就是提供利用微生物,使α-羟基酸以高浓度蓄积,有效地制备α-羟基酸的方法。
发明的揭示本发明者们对由通式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中,R表示氢原子、可带有取代基的C1~C6的烷基、可带有取代基的C2~C6的链烯基、可带有取代基的C1~C6的烷氧基、可带有取代基的芳基、可带有取代基的芳氧基或可带有取代基的杂环基
)表示的α-羟基***[Ⅰ]生成通式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R如前所述)表示的α-羟基酸[Ⅱ]所用的微生物进行研究时,对不因高浓度的α-羟基***[Ⅰ]或α-羟基酸[Ⅱ]的影响而活性降低、具有维持长时间活性的耐久性,且具有蓄积高浓度α-羟基酸[Ⅱ]能力的在工业上有效的微生物进行了探索。
其结果是,属于バリオボラクス(Variovorax)属和节孢子杆菌属(Arthrobacer)的微生物显现出所需的活性。此外,还发现如果在该反应体系中添加通式[Ⅲ]:Mm(CN)n(式中,M表示氢原子、铵或金属离子,m、n表示1~3的整数)表示的***化物,就可改善酶活性,从而完成了本发明。
即,本发明是通过微生物的作用使α-羟基***[Ⅰ]水解,转变为α-羟基酸[Ⅱ]的α-羟基酸[Ⅱ]的制备方法,其特征是,通过对α-羟基***[Ⅰ]及/或α-羟基酸[Ⅱ]具有浓度耐性和耐久性的微生物,使α-羟基酸[Ⅱ]在水性溶剂中生成蓄积,并加以收集,采用该方法的同时还在该反应体系中添加***化物。
以下,对本发明进行详细说明。
本发明所用的微生物只要是能够达到本发明的目的的对α-羟基***或α-羟基酸具有浓度耐性,且具有维持长时间活性的耐久性的微生物即可,对其没有特别的限定。这些微生物包括バリオボラクスパラドキサス(Variovoraxparadoxus)
的IAM12374株和节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株(FERMP-15424)。这些微生物中,能够从东京大学分子细胞生物研究所(IAM)很容易地获得バリオボラクスパラドキサス(Variovoraxparadoxus)IAM12374。节孢子杆菌(Arthrobacter)NSSC104是本发明者们从自然界中新分离出来的,其保藏情况如下保藏编号FERMBP-5829(从微工研菌寄第P-15424移交)保藏日期1996年2月6日国内保藏,1997年2月20日国际保藏保藏单位地址日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号保藏单位名称国立生命科学和人体技术研究所又,节孢子杆菌(Arthrobacter)NSSC104的细菌学性质如下。
形态多形性杆菌革兰氏染***+杆状-球状循环+芽胞-运动性-细胞壁的二氨基酸赖氨酸对氧的需求好氧氧化酶-过氧化氢酶+DNA的分解+明胶的液化+
淀粉的分解+酪蛋白的分解+维生素的需求性-乙醇酰试验-(乙酰型)苯醌系MK-9(H2)细胞壁的糖组成半乳糖+葡萄糖+以上的细菌学性质是以《贝基氏分类细菌学手册》(Bergey′sManualofSystematicBacteriology(1986))为基础的检索结果,可确认NSSC104株是属于节孢子杆菌(Arthrobacter)属的菌株。该菌株以上述保藏编号被保藏在国立生命科学和人体技术研究所。
以下,对本发明的具体实施状态进行说明。
培养本发明所用的微生物可在包含酶诱导物,能够提供微生物同化的碳源、氮源、无机离子,如有必要还包含有机营养源的普通培养基中进行。作为酶诱导物可使用异丁***等***类化合物、ε-己内酰***等环状酰***化合物。作为碳源可使用葡萄糖等碳水化合物、乙醇等醇类、有机酸及其他适当的物质。作为氮源可使用氨基酸、***盐、铵盐及其他适当的物质。作为无机离子可使用磷酸离子、钾离子、镁离子、硫酸离子、铁离子,如有必要还可使用其他适当的物质。作为有机营养源可使用维生素、氨基酸等及包含上述物质的玉米浸渍液、酵母提取物、细菌培养基用的胨、牛肉汁及其他适当的物质。培养可在需氧条件下,将pH、温度分别控制在6~9、25~37℃的适当范围内而进行。
通过本发明所用的微生物进行的水解反应是取用以上培养的菌体,如有必要,调制成固定化菌体、粗酶、固定化酶等菌体处理物,在水性溶剂中使其与α-羟基***[Ⅰ]接触而进行的。固定化菌体或酶时适用的是载体结合法、遮盖法等常用的固定化技术。调制粗酶时适用的是用超声波、高压匀化器等将菌体粉碎后,利用硫铵盐析法、色谱法等常用酶精制技术。~10重量%的菌体,反应结束后,菌体通过过滤、离心分离或超过滤膜浓缩法被回收,可反复用于水解反应。作为水性溶剂,可使用水、缓冲液等盐类或包含有机溶剂的水溶液,它们可分成二相。
本发明所用的通式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的α-羟基***[Ⅰ]中的R表示氢原子、可带有取代基的C1-C6的烷基、可带有取代基的C2~C6的链烯基、可带有取代基的C1~C6的烷氧基、可带有取代基的芳基、可带有取代基的芳氧基或可带有取代基的杂环基。
具体包括氢原子,***、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等C1~C6的烷基,***硫代***、1-***硫代乙基、2-***硫代乙基、1-***硫代丙基、2-***硫代丙基、3-***硫代丙基、1-***硫代丁基、2-***硫代丁基、3-***硫代丁基、4-***硫代丁基、6-***硫己基、乙基硫代***、1-乙基硫代乙基、2-乙基硫代乙基、1-乙基硫代丙基、2-乙基硫代丙基、3-乙基硫代丙基、1-乙基硫代丁基、2-乙基硫代丁基、3-乙基硫代丁基、4-乙基硫代丁基、丙基硫代***、1-丙基硫代乙基、2-丙基硫代乙基、1-丙基硫代丙基、2-丙基硫代丙基、3-丙基硫代丙基、1-***硫代异丙基、1-乙基异丙基、1-丙基硫代丁基、2-丙基硫代乙基、3-丙基硫代丁基、4-丙基硫代丁基、丙基硫代***、1-丙基硫代乙基、2-丙基硫代乙基、1-异丙基硫代丙基、2-异丙基硫代丙基、3-异丙基硫代丙基、1-异丙基硫代丁基、2-异丙基硫代丁基、3-异丙基硫代丁基、4-异丙基硫代丁基等C1~C6烷基硫代
C1~C6烷基,羟***、1-羟乙基、2-羟乙基、1-羟丙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-羟丁基、1-羟基异丙基、2-羟丁基、3-羟丁基等羟基C1~C6烷基,羧***、2-羧乙基、1-羧乙基、3-羧丙基、2-羧丙基、1-羧丙基等羧基C1~C6烷基,氨基甲酰***、1-氨基甲酰乙基、2-氨基甲酰乙基、1-氨基甲酰丙基、2-氨基甲酰丙基、3-氨基甲酰丙基等氨基甲酰C1-C6烷基,巯基***、1-巯基乙基、2-巯基乙基、1-巯基丙基、2-巯基丙基、3-巯基丙基等巯基C1-C6烷基,胍基***、1-胍基乙基、2-胍基乙基、1-胍基丙基、2-胍基丙基、3-胍基丙基等胍基C1~C6烷基,可带有苄基、2-***苄基、4-***苄基、4-甲氧基苄基、3-硝基苄基、4-羟苄基、α-***苄基、α,α-二***苄基等取代基的C1-C6芳烷基,可被3-吲哚基***、2-吲哚基***、2-(3-吲哚基)乙基、1-(3-吲哚基)乙基、2-吲哚基***、2-(2-吲哚基)乙基、1-(2-吲哚基)乙基、4-咪唑基***、2-咪唑基***、1-(4-咪唑基)乙基、2-(4-咪唑基)乙基等杂环基取代的C1~C6烷基,可带有乙烯基、丙烯基、异丙烯基、烯丙基、1-***烯丙基、2-***烯丙基、丁烯基等取代基的C2~C6链烯基,可带有甲氧基、乙氧基、丙氧基、三***甲氧基等取代基的C1~C6烷氧基,可带有苯基、2-***苯基、对甲苯基、3-硝基苯基、4-***基苯基、α-萘基、β-萘基等取代基的芳基,可带有苯氧基、2-***苯氧基、对甲苯氧基、3-硝基苯氧基、α-萘氧基、β-
萘氧基等取代基的芳氧基,2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-***-3-吡啶基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-呋喃基、3-呋喃基等包含至少一种选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子的3~7元杂环基。
更具体的α-羟基***[Ⅰ]包括乳***、苯乙醇***、2-羟基-4-***硫代丁***等。
上述α-羟基***[Ⅰ]~50重量%的浓度进行反应,如有必要,可在反应过程中逐渐添加。利用适当的缓冲剂或酸和碱可将反应液的pH值保持在5~11之间。反应温度一般为4~50℃,较好的是保持在20~40℃。
本发明所用的通式[Ⅲ]表示的***基化合物包括氢***酸、***化钠、***化钾、***化钙、***化镁、***化***、***化铵等。***~1000mM,较好是在4~500mM的范围内,如有必要,可在反应过程中逐渐添加。
这样,在6小时~120小时添加的对应于α-羟基***[Ⅰ]的α-羟基酸[Ⅱ]作为铵盐就以15重量%以上的高浓度蓄积。反应所用菌体的活性实质上没有降低,能够反复用于水解反应。
生成物能够通过浓缩、萃取等常用方法分离精制,如有必要,可通过酸性条件下的有机溶剂萃取、热分解等方法与氨分离,作为生成物的α-羟基酸[Ⅱ]包括乳酸、扁桃酸、2-羟基-4-***硫代丁酸等。
实施发明的最佳状态以下,通过实施例对本发明进行更为详细的说明。
%肉汁、%%食盐的培养基装入试管中,再将以下组成的20ml培养基装入容量为100ml的附有挡板的三角烧瓶中,分别在121℃灭菌15分钟。用接种环在2ml的试管中植入バリオボラクスパラドキサス(Variovoraxparadoxus)的IAM12374株,于30℃振荡1晚培养后,,于30℃振荡培养3天。离心分离该培养液,用生理盐水洗净所得菌体,换算成干燥重量,%()中。然后,在其中添加2-羟基-4-***硫代丁***,使其最终浓度变为160mM,于30℃缓慢地振荡,进行水解反应。添加结束后每12小时添加等量的2-羟基-4-***硫代丁***,重复9次,反应总计进行120小时。反应结束后,离心分离反应液,除去菌体,用高速液相色谱法(柱子TSKgelODS-80TM,载体乙***/水/三***乙酸=20/80/)对包含在离心后的上清液中的2-羟基-4-***硫代丁酸的浓度进行定量的结果是,蓄积了25重量%的2-羟基-4***硫代丁酸铵盐。(收率为98%)。
%%%%%%ε-己内酰***%(用2N的氢氧化钠调整)实施例2将2ml包含