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使用xpd解旋酶表征多核苷酸的方法
本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法利用孔和XPD解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
【专利说明】使用XPD解旋酶表征多核苷酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。该方法使用孔及xro解旋酶。解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
【背景技术】
[0002]当前需要一种适合于各种应用的快速且廉价的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和鉴定的技术。现有技术很慢并且昂贵,这主要是因为它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸并需要大量专门的荧光化学物质来检测信号。
[0003]当跨膜孔(纳米孔)具有极大的用作聚合物及多种小分子的直接的电生物传感器的潜力。特别是,最近关注的是将纳米孔作为潜在的DNA测序技术。
[0004]当跨纳米孔施加电势时,当分析物,如核苷酸,在桶内短暂停留一定时间段后,电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸得到已知标志(signature)的电流变化和持续时间。在“链测序”(“StrandSequencing”)方法中,使单个多核苷酸链穿过孔
,得到对该核苷酸的鉴定。链测序可包括,使用核苷酸调控蛋白来控制多核苷酸穿过孔的运动。
【发明内容】
[0005]本发明已经证明了XPD解旋酶可控制多核苷酸穿过孔的运动,尤其是当对所述孔施加电势,例如电压时。解旋酶能够以可控和逐步的方式逆着或顺着由施加电压得到的场移动目标多核苷酸。出人意料的是,解旋酶能够在高盐浓度下起作用,所述高盐浓度对表征多核苷酸有利,特别是对使用链测序确定其序列有利。这将在下面更详细地讨论。
[0006]因此,本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法,包括:
[0007](a)使目标多核苷酸与跨膜孔及XPD解旋酶接触,使得目标多核苷酸移动穿过所述跨膜孔,并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动;和
[0008](b)当所述目标多核苷酸相对于所述跨膜孔移动时,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸。
[0009]本发明还提供了:
[0010]-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法,包括在孔和XPD解旋酶之间形成复合体并从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器;
[0011]-xro解旋酶在控制目标多核苷酸穿过孔的运动中的应用;
[0012]-一种表征目标多核苷酸的试剂盒,其包括(a)孔和(b)Xro解旋酶;和
[0013]-—种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置,包括多个孔和多个XPD解旋酶;
[0014]-—种表征目标多核苷酸的方法,包括:
[0015](a)使目标多核苷酸与xro解旋酶接触,使得xro解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动;和
[0016](b)当xro解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动时,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并从而表征所述目标多核苷酸;
[0017]-XPD解旋酶在表征目标多核苷酸过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用;
[0018]-xro解旋酶在对目标多核苷酸的一部分或全部进行测序的过程中,控制目标多核苷酸的运动中的应用;
[0019]-一种用于表征样本中目标多核苷酸的分析装置,其特征在于其包括XPD解旋酶;和
[0020]-一种表征目标多核苷酸的试剂盒,包括(a)用于表征所述目标多核苷酸的分析装置和(b)xro解旋酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1A)为使用解旋酶控制DNA移动穿过纳米孔的实施例的示意图。反侧的箭头显示了
DNA的运动方向。顺侧的箭头显示了解旋酶相对于DNA的运动方向。从左到右,具有含胆固醇标签的退火引物的单链DNA底物(图1B)被添加到双分子层的顺侧。胆固醇标签结合到双分子层,将所述底物富集在双分子层表面。添加到顺式隔室(ciscompartment)的解旋酶结合到DNA。在二价金属离子和NTP底物存在时,解旋酶沿着DNA移动。在施加的电压下,所述DNA底物经DNA上的前导区部分被纳米孔捕获。在施加的电势的力的作用下,所述DNA被牵拉穿过所述纳米孔直到结合到DNA上的解旋酶与所述孔的顶部接触,防止进一步的不受控的DNA移位。所述解旋酶沿着所述DNA以5’到3’的方向运动,便于使螺旋状(threaded)DNA顺着施加的电场受控移位而穿过所述纳米孔。所述解旋酶促使DNA移位穿过纳米孔,使其进入反式隔室。穿过纳米孔的DNA的最后部分为3’端。当解旋酶已促使DNA穿过纳米孔的移位完成时,该解旋酶从该链上解离。图1B为在本实施例中使用的DNA底物设计之一。
[0022]图2显示了解旋酶能够以受控方式使DNA移动穿过纳米孔,随着DNA移动穿过纳米孔,电流发生逐步变化。示例解旋酶-DNA事件(140mV,400mMNaCl,,,10nMXPDMbu,ImMDTT,ImMATP,ImMMgCl2)。上部)为,获得的XPD400merDNA事件穿过MspAB2纳米孔的电流对时间的分图。开孔电流为~95pA。在施加的电势
(+140mV)的力的情况下,DNA被纳米孔捕获。连接有酶的DNA得到长的模块(block)(在该条件下,在~25pA),随着酶使DNA移动穿过所述纳米孔,该模块显示出逐步变化的电流。下部),该下分图显示了解旋酶控制DNA运动事件之一的放大图,示出了DNA-酶的捕获、当DNA被牵拉出所述纳米孔时电流的逐步变化。
[0023]图3显示了解旋酶控制DNA运动事件的另一个例子。下部)为,所述事件的一部分的放大图,示出了当DNA链不同部分移动穿过纳米孔时电流的逐步变化。
[0024]图4显示了解旋酶至少以两种操作模式控制DNA的移动。解旋酶沿着DNA的5’到3’的方向运动,而DNA在纳米孔中的定向(取决于该DNA的哪一端被捕获)是指,所述酶能用于将DNA逆着施加的电场移出所述纳米孔,或者将DNA顺着该施加的电场移入所述纳米孔。左图)为,当DNA的3’端被捕获时,解旋酶逆着电压所施加的电场的方向起作用,将螺旋状DNA牵拉出纳米孔,并进入顺式隔室中。右图)为,当DNA的5’端(5’-down)向下被捕获到纳米孔中时,解旋酶沿着电场的方向将DNA移动到纳米孔中,并进入到双分子层的反侧。
[0025]图5显示了测试酶活性的荧光试验。A)使用常规的荧光底物来检测解旋酶用于置换(displace)杂交的双链DNA的能力。I)荧光底物链(50nM终浓度)具有5’单链DNA悬突,以及杂交的双链
DNA的40个碱基部分。主链上部(majorupperstrand)在3’末端具有羧基荧光素碱基,并且所述杂交的互补链在5’末端具有黑洞淬灭剂(black-holequencher(BHQ-1))碱基。当杂交时,荧光素的荧光被局部的BHQ-1淬灭,并且底物基本上是无荧光的。该试验中包括与荧光底物的较短链互补的IμM捕获链。2)在ATP(ImM)和MgCl2(1mM)的存在下,添加到底物的解旋酶(150ηΜ)结合至荧光底物的5'尾部,沿着主链移动,并如所示置换互补链。3)具有BHQ-1的互补链完全被置换,主链上荧光素发荧光。4)过量的捕获链优选与互补链DNA退火以防止初始底物重新退火并防止丢失荧光。B)显示了在含有10mM至2Μ的不同浓度的KCl的缓冲溶液(,ImMATP,1mMMgCl2,50nM荧光底物DNA,IμM捕获DNA)中的MbuXPD解旋酶活性的初始速率的图。
[0026]图6为实施例1中所用的垫片(spacer)iSpl8的结构。
[0027]序列表的说明
[0028]SEQIDNO:1示出了密码子优化的、编码MS-Bl突变MspA单体的多核苷酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。
[0029]SEQIDNO:2示出了MspA单体的MS-Bl突变的成熟形式的氨基酸序列。该突变缺少信号序列并包括下列突变
:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。
[0030]SEQIDN0:3示出了编码α-溶血素_E111N/K147N(a-HL-NN;Stoddartetal.,PNAS,2009;106(19):7702-7707)的一个亚基的多核苷酸序列。
[0031]SEQIDN0:4示出了a-HL-NN的一个亚基的氨基酸序列。
[0032]SEQIDNO:5至7示出了MspB、C和D的氨基酸序列。
[0033]SEQIDN0:8和9示出了XPD模序(motif)V和VI的氨基酸序列。
[0034]SEQIDNO:10至62示出了表5中XPD解旋酶的氨基酸序列。
[0035]SEQIDNO:63至68示出了各实施例中使用的序列。
具体实施方案
[0036]应理解的是,公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需求进行调整。还应理解的是,本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案,不意欲进行限制。
[0037]另外,如在本说明书和所附权利要求书中使用的,单数形式的“一个”、“所述”包括复数指代物,除非文中另有明确说明。因此,例如,涉及“一个孔”时包括两个或多个这样的孔,涉及“一个解旋酶”时包括包括两个或多个这样的解旋酶,涉及“一个多核苷酸”时包括两个或多个多这样的多核苷酸,等。
[0038]所有在本文中引用的出版物、专利和专利申请,无论前文或后文,均以全文参考的方式纳入本文中。
[0039]本发明的方法
[0040]本发明提供了一种表征目标多核苷酸的方法。所述方法包括使目标多核苷酸与跨膜孔和XPD解旋酶接触,使得目标多核苷酸移动穿过孔,并使XPD解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。然后当目标多核苷酸相对于孔移动时,使用本领域已知的标准方法测量该目标多核苷酸的一个或多个特征。所述目标多核苷酸的一个或多个特征优选在该多核苷酸移动穿过所述孔时进行测量。步骤(a)和(b)优选通过跨所述孔施加电势而实施。如下文更详细的论述,施加电势通常导致在所述孔和解旋酶之间形成复合体。所施加的电势可以是电压电势。替代地,所施加的电势可以是化学电势。其一个例子是在跨***分子层中使用盐梯度。Holden等人,;129(27):8650-5中公开了盐梯度。
[0041]在一些情形中,当多核苷酸相对于所述孔而移动时,使用穿过所述孔的电流来确定目标多核苷酸的序列。这就是链测序。
[0042]所述方法具有多个优势。首先,本发明人出乎意料地发现XPD解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性,因此本发明方法可以在高的盐浓度下实施。在链测序中,电荷载体,诸如盐,是产生导电溶液必须的,所述导电溶液用于施加补偿电压以捕获和异位目标多核苷酸以及当目标多核苷酸相对于孔移动时测定产生的序列依赖性电流变化。由于测量信号依赖于盐浓度,因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得
信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比,并使得在正常电流波动的背景下,代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序,超过10mM的盐浓度是理想的,例如超过400mM,600mM或800mM的盐浓度。本发明人出乎意料地发现xro解旋酶能在极高的盐浓度下有效发挥作用,例如IM的盐浓度下。本发明包括在超过IM的盐浓度下,例如2M盐浓度下有效发挥作用的解旋酶。
[0043]第二,当施加电压时,XPD解旋酶能出乎意料地朝两个方向,即逆着或顺着由施加的电压产生的电场而移动目标多核苷酸。因此,本发明的方法可以一种或两种优选方式实施。根据目标多核苷酸相对所述孔移动的方向,即顺着或逆着电场的方向,获得不同的信号。下面将对这进行更详细地论述。
[0044]第三,xro解旋酶通常每次移动目标多核苷酸中的一个核苷酸穿过所述孔。xro解旋酶由此能起到类似单碱基棘齿(ratchet)的作用。当然,这在测序目标多核苷酸时是有利的,因为使用所述孔可以鉴定目标多核苷酸中的基本全部的一如果不是全部的话一核苷酸。
[0045]第四,xro解旋酶能够控制单链多核苷酸和双链多核苷酸的移动。这意味着根据本发明能够表征多种不同的目标多核苷酸。
[0046]第五,xro解旋酶对施加的电压产生的电场表现出极大的耐受性。本发明人发现在“解链”(“unzipping”)状态下多核苷酸几乎不发生移动。解链状态通常是在缺乏核苷酸,例如缺乏ATP时候出现。当所述解旋酶在解链模式下操作时,其作用类似闸,防止目标序列在所施加电压的影响下太快地移动穿过所述孔。这是很重要的,因为这意味着,当逆着所施加电压产生的电场移动多核苷酸时,不会发生由不希望的“向后”移动而产生的问题。
[0047]第六,xro解旋酶容易制备和容易操控。因此它们适合用于直接且便宜的测序方法。
[0048]本发明方法是用于表征目标多核苷酸。多核苷酸,例如核酸,是一种含有两个或多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何组合。所述核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或***化。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被破坏。所述目标多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被修饰,例如使用标记或标签。所述目标核苷酸可以包括一个或多个间隔物。