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专利名称:作用于酪氨酸激酶以诊断和治疗骨关节炎的方法和组合物的制作方法
技术领域:
OA主要为非炎性疾病,其特征在于关节软骨的渐进损失引起的关节疼痛和强直。OA为最常见的年龄相关疾病之一,估计其影响全世界约5,600万人或60岁以上人口的80%。虽然一般认为OA为退化病症,但是此疾病与软骨细胞的活化相关,其中所述的软骨细胞为正常关节软骨中存在的主要细胞类型。此细胞活化的标志包括肥大、增殖、去分化、现存细胞外基质的降解和最终的细胞凋亡。
OA的分子病因学仍然未知。因此当前治疗OA的疗法针对于缓解症状(如减少关节疼痛和续发的炎性变化),而不是针对于治疗疾病的根本原因。目前还没有阻止疾病进程的药物介入。许多患者因此发展到必需进行全关节置换术的疾病晚期。综述请见Pritzker,Brandt等编,《(Osteoarthritis》,OxfordUniversityPress,50-61页(1998)。也见Sandell&Aigner,ArthritisRes.,第3卷,,107-113页(2001)。
大规模的OAcDNA文库测序鉴定出多种推定的病态软骨细胞表达的基因产物或“标记基因”。见Stokes等,ArthritisRheum.
,第46卷,,404-419页(2002);Hu等,.,第273卷,,34406-34412页(1998),Aigner等,ArthritisRheum.,第44卷,,-2789(2001);以及Kumar等,OsteoarthritisCartilage.,第9卷,,641-653页(2001)。然而尚未获得这些基因产物的功能信息,它们即使与OA有关,其作用也仍然未知。因此,OA的分子基础仍然未知,并且只知道极有限数量的潜在药物靶。
因此仍然需要治疗OA和相关疾病的治疗化合物和方法。还需要可能有用的新基因和基因产物,例如此类OA疗法的药物靶。还需要新的方法,尤其需要新的鉴定此类药物靶的新筛选测定法。
发明概述本发明涉及治疗和诊断OA的方法和组合物。本发明具体提供了受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员和其配体(例如GAS6和PROS1)的新用途,该亚家族包括TYRO3、Axl和cMer。申请人惊奇地发现TYRO3和其配体(特别是GAS6)在来自患有OA的个体的软骨细胞和组织中表达水平有所提高。此外,软骨细胞中TYRO3或Axl表达的提高和/或用TYRO3配体处理软骨细胞引起OA相关的若干不同基因的表达,而TYRO3、Axl或cMer的抑制(例如通过RNA干扰)阻断了IL-1或TNF介导的OA遗传标记的诱导表明受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族可能在体内介导软骨降解中发挥关键作用并因此是发展治疗、预防或减轻
OA的新治疗法的有用的药物靶。
因此,本发明提供使用受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员(例如TYRO3、AXL和cMer)和/或其配体例如(GAS6或PROS1)的新筛选测定法来鉴定治疗OA的化合物。一方面,这些方法包括使测试化合物与含有TYRO3亚家族成员多肽和其配体的反应混合物接触,尤其是在允许配体与多肽结合以形成结合复合体的条件下接触。在优选的方面,TYRO3亚家族成员多肽为TYRO3,并且配体为TYRO3配体。然后可在存在测试化合物的反应混合物中检测结合复合体的形成水平,将这些水平与在不含测试化合物的条件下形成的结合复合体水平相比较。在这样的方法中,存在测试化合物条件下形成的结合复合体水平的下降表明测试化合物可用于治疗OA。
在这些方法的优选实施方案中,TYRO3多肽为包含SEQIDNO2中所列氨基酸序列的多肽。在其他优选的实施方案中,TYRO3配体为GAS6多肽,优选为包含SEQIDNO3中所列氨基酸序列的多肽。
其他方面,本发明还提供确诊患有OA的个体的诊断方法。在一个实施方案中,这些方法包括检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体的)生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中编码受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族多肽成员的核酸,优选TYRO3核酸,并比较所述生物试样中该核酸的水平与未患有OA的个体的核酸水平。在这样的实施方案中,所述生物试样中该核酸提高的水平表明该个体确实患有
OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
在其他的实施方案中,本发明的诊断方面包括检测检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体)的生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中属于受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族的多肽的水平,优选检测TYRO3多肽的水平,并比较所述生物试样中该多肽的水平与未患有OA个体中该多肽的水平。在这样的实施方案中,个体生物试样中该多肽提高的水平表明个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
这些诊断方法特别优选的实施方案中,TYRO3多肽可为具有SEQIDNO2中所列氨基酸序列的多肽,TYRO3核酸可为编码具有SEQIDNO2中所列氨基酸序列多肽的核酸。
另外,本发明还提供了使用受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族成员的配体,优选使用TYRO3配体(如GAS6或PROS1)鉴定患有OA的个体的诊断方法。例如,在一个实施方案中,此类方法包括检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体)的生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中编码TYRO3亚家族成员配体的核酸,并比较所述生物试样中核酸水平与未患有OA的个体的核酸水平。在这样的实施方案中,编码该配体核酸的提高的水平表明个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
在其他的实施方案中,本发明的诊断方面包括检测来源于个体(例如OA患者或怀疑患有OA的其它个体的生物试样(例如软骨细胞、软骨组织和/或滑膜液或血清)中TYRO3亚家族成员配体多肽,优选检测TYRO3配体多肽并比较所述生物试样中该配体多肽的水平与未患有OA的个体中配体多肽的水平。在这样的实施方案中,所述个体生物试样中该配体多肽提高的水平表明个体确实患有OA或个体要么具有增加的出现OA的危险。
在这些诊断方法特别优选的实施方案中,TYRO3配体优选为GAS6多肽,如包含SEQIDNO3中所列氨基酸序列的多肽。同样,编码TYRO3配体的核酸优选为编码GAS6的核酸,如编码SEQIDNO3中所列氨基酸序列的核酸。在特别优选的实施方案中,编码TYRO3配体的核酸包含SEQIDNO4中所列的核苷酸序列。
在另一方面,本发明涉及治疗、预防或减轻OA的方法,其包括给需要的受试者施用包含有效剂量的TYRO3亚家族成员和/或其配体调节剂的药物组合物。在多种优选的实施方案中,该药物组合物包含一种或多种TYRO3、Axl、cMer和/或其配体的调节剂。
另一方面,本发明涉及药物组合物,其包含能在需要的受试者中治疗、预防或减轻OA的有效剂量剂量的TYRO3亚家族成员和/或其配体的调节剂,其中所述调节剂例如可抑制或与任何一个或多个此亚家族成员
(例如TYRO3、Axl和cMer)结合的配体的活性、表达。在一个实施方案中,该药物组合物包含任何一种或多种选自针对TYRO3亚家族成员或其配体核酸序列的反义寡核苷酸、三螺旋DNA、siRNA、核酶、RNA适体或双链或单链RNA的物质,其中设计所述的物质用以抑制该家族成员或配体的表达。在另一个实施方案中,该药物组合物包含TYRO3亚家族成员或其配体的抗体,其中该抗体可例如抑制该成员和/或配体的活性。
还在本发明的另一方面,提供了包含检测来源于患者的生物试样中编码TYRO3亚家族成员或其配体的多核苷酸表达水平或检测该成员或其配体或其片段多肽水平的必需组分的测定法和试剂盒,此类试剂盒包含,例如与该多肽或其片段结合的抗体或与该多核苷酸杂交的寡核苷酸探针。在优选的实施方案中,此类试剂盒也包含详述操作的说明书,通过它使用试剂盒组分。
发明详述本发明涉及在此称为受体酪氨酸激酶TYRO3亚家族的受体酪氨酸激酶亚家族,其包含同源蛋白质TYRO3、Axl和cMer。在此公开的数据表明这些多肽参与OA的发病机理并因此设想这些多肽和其配体为发展治疗、预防或减轻OA及相关病症的疗法的适当药物靶。
TYRO3多肽已在例如Polvi等,Gene,第134卷,,289-293页(1993);Schultz等,.,第28卷,273-280
页(1995)中有所描述。TYRO3也称为SKY、TIF、RSE、DTK和BRT。见Ohashi等,Oncogene,第9卷,699-705页(1994);Dai等,Oncogene,第9卷,975-979页(1994);Mark等;.;第269卷;10720-10728页(1994);Fujimoto等,Oncogene,第9卷,693-698页(1994)。优选的TYRO3氨基酸序列可从GenBank数据库获得并且登录号为NP_006284(SEQIDNO2)。优选的编码此TYRO3多肽的cDNA序列也可从GenBank获得并具有登录号NM_006293(SEQIDNO1)。cDNA序列的225-2897核苷酸与编码SEQIDNO2氨基酸序列的开放阅读框(ORF)或“编码序列”(CDS)相对应。
TYRO3受体与也称为UFO或ARK的受体酪氨酸激酶Axl(描述见O’Bryan等,.,第11卷,5016-5013页(1991);Janssen等,Oncogene,第6卷,2113-2120页(1991);Rescigno等;Oncogene;第6卷;1909-1913页(1991);Axl剪接变体Axlv1和Axlv2的GenBank登录号分别为NM_021913,SEQIDNO32和NM_001699,SEQIDNO30)和也称为EYK的受体酪氨酸激酶cMer(见Graham等,CellGrowthDiffer.,第5卷,647-657页(1994);Jia等,.,第269卷,1839-1844页(1994);GenBank登录号NM_006343和NP_006334;SEQIDNO34和SEQIDNO35)具有结构和序列同源性。总之,这三个多肽限定了这样一个酪氨酸激酶受体亚家族,它们各具有相似的胞外域,共有约35%的氨基酸序列同一性并包含两个免疫球蛋白样结构域和两个纤连蛋白
III型重复。见Schulz等,.,第28卷,273-280页(1995)。
已经描述了至少一个特异结合并活化TYRO3的配体。见例如Varnum等,Nature,第373卷,623-626页(1995);Stitt等,Cell,第80卷,,661-670页(1995);Manfioletti等,.,第13卷,4976-4985页(1993)。此配体的代表性氨基酸序列也称为“生长抑制特异蛋白质6”或“GAS6”,其可以从GenBank数据库获得并且登录号为NP_000811(SEQIDNO3)。优选的编码GAS6多肽的核苷酸序列可从GenBank登录号NM_000820(SEQIDNO4)获得。此cDNA序列尤其含有包含SEQIDNO4135-2171核苷酸残基的开放阅读框。GAS6也表现为其他TYRO3亚家族成员、Axl和cMer的配体。见例如Nagata等,.,第271卷,30022-30027页(1996)。
另一个特异结合TYRO3的配体是称为ProteinS的蛋白质。见Stitt等(1995),前文;Wimmel等,Cancer,第86卷,,43-49页(1999)。优选的编码ProteinS多肽(PROS1)的核苷酸序列可从GenBank登录号NM_000313获得并且在此也以SEQIDNO28提供。代表性的优选PROS1氨基酸序列也可从GenBank登录号NP_000304(SEQIDNO29)获得。
如下面实施例中公开的,申请人发现TYRO3、Axl、cMer和