体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素的制作方法.docx

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专利名称:体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素的制作方法
技术领域:
本发明涉及用植物凝集素诱导树突状细胞(DC)成熟和増殖的方法,特别涉及红桂木凝素诱导树突状细胞成熟和増殖的培养基。
背景技术:
植物凝集素是ー类具高度特异的糖结合活性的蛋白,其最大的特点在于识别糖蛋白和糖脂,特别是细胞膜中复杂结构的糖链即细胞膜表面决定簇。植物凝集素能与动物、植物、微生物细胞发生特异的作用,引起或增强细胞内吞作用或细胞间转运,诱发一定的生理效应。它可以储存物质;抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵;还作为促有丝分裂因子,调节细胞的分裂和生长。由于凝集素能选择性地识别细胞膜糖脂或糖蛋白糖链的不同糖基,在生化、医学上,植物凝集素常用于细胞的分型、分离、糖蛋白和有丝分裂原的纯化、癌化学的研究等。随着基因工程的发展,植物凝集素已成为一种很有潜カ对抗疾病的工具,在免疫学、肿瘤、生物学等方面得到诸多应用。红桂木凝集素(ArtocarpusLingnanensisLectin,ALL)是我们的相关研究人员对30多种生长在广西东南部地区的植物种子经过精心筛选出来的植物凝集素,前期研究表明它具有很强的促进
T淋巴细胞増殖活性。在抗肿瘤免疫治疗中,DC是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞,外周的DC摄取外来抗原后,保留并提呈此抗原,同时发生迁移,进入淋巴结内初始T细胞循环池,能显著地刺激初始型T细胞増殖,启动、调控、維持免疫应答;能递呈抗原给MHCI类限制性⑶8+和MHCII类限制性⑶4+T淋巴细胞,把加工处理的抗原肽提呈在细胞膜表面上,并表达高水平的协同刺激分子和粘附分子,以保证与T细胞结合并促进T细胞的有效激活,诱导特异性免疫反应。DC在体内分布广泛,但数量少(仅占外周血单个核细胞的1%左右)且分散,但可由CD34+细胞或单核细胞诱导、衍生、增殖培养。目前培养DC的细胞因子组合方案有多种,在培养基中仅加入rhGM-CSF和rhIL-4,只能培养出不成熟的DC。目前通常采用TNF-α,IFN-Y等在体外诱导DC的成熟,而TNF-α价格昂贵。为解决这ー问题,我们从正常人外周血分离单核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)和红桂木凝集素联合诱导培养8d,获得成熟DC,为DC的进ー步研究及应用免疫治疗奠定实验基础。经检索,红桂木凝集素诱导人外周血树突状细胞的成熟和増殖未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种体外诱导树突状细胞成熟和増殖的红桂木凝集素。本发明的又一目的在于利用红桂木凝集素制备成熟的树突状细胞。本发明是这样实现的ー种体外诱导树突状细胞成熟和増殖的红桂木凝集素,其特征在于添加红桂木凝集素作为诱导树突状细胞成熟和増殖的专用培养基,是在树突状细胞培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素;所述树突状细胞培养基是含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基;所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是22-220μg/mL。以上所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是44μg/mL。红桂木凝集素的诱导树突状细胞成熟和增殖的方法,是在树突状细胞培养基中加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子,培养到第6天时,加入红桂木凝集素,继续培养2天,制备成熟的树突状细胞;所述的前体细胞来自人外周血单个核细胞。以上所述的诱导因子为GM-CSF和IL-4,诱导因子在加入树突状细胞的前体细胞的第一天加入,所述的GM-CSF的浓度为15ng/mL,所述的IL-4的浓度为15ng/mL。以上所述的培养温度为37°C,CO2浓度为5%,湿度为饱和湿度,每2天换一次新鮮的培养基。,所获得的树突状细胞高表达⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR等,抗原递呈能力增强,因此本发明为进ー步开展对DC的深入研究及临床免疫治疗打下了基础,为临床实体肿瘤的生物治疗提供一条新的路
径,也为进一歩开发疫苗增强剂提供了新型有效的途径。-12和TNF-α,从而诱导ThO细胞向Thl方向分化。Thl细胞主要介导细胞免疫反应,在诱发器官特异性自身免疫病,器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调节作用。,克服了目前在培养基中仅加入rhGM-CSF和rhIL-4,只能培养出不成熟的DC和采用TNFα、IFN-Y等在体外诱导DC的成熟而TNF-α和IFN-Y价格昂贵的问题。,方便实用,与现有的方法相比利用的细胞因子少,费用低,且细胞成熟度高,功能强,在树突状细胞的基础研究及临床应用具有广泛的前景。
图I:细胞生长的形态学图片;图I的说明a-ALL浓度为O;b_ALL浓度为44μg/mL;c_ALL浓度为220μg/mL;d-TNFα浓度为50ng/mL。图2=ELISA法检测TNFa的含量。图3=ELISA法检测IL-12的含量。图4:流式细胞术鉴定DC表面标志;图4的说明a_CDla的表达;b_CD83的表达;c_CD86的表达;d_CD40的表达;e-HLA-DR的表达。图5=ALL诱导的DC促进异体T细胞増殖。图6:ALL促进DC增殖。
具体实施例方式下面通过实施例,对本发明的技术方案进ー步具体的说明。实施例
I红桂木凝集素的获得红桂木凝集素的分离纯化的所有操作,均在4°C下进行。先取红桂木种子30g,粉碎研磨,按1:/LNaCl,,磁力搅拌器搅拌2h,浸泡抽提24h。抽提液凝血活力在29-2n之间。将抽提液过滤,滤液以3000rpm离心15min,于上清液中加入硫酸铵至30%饱和度。3000rpm离心20min,弃沉淀物。上清液同上法加入硫酸铵至60%饱和度,放置12h。3000rpm离心20min。弃上清液,/LNaCl,-。将粗提液依次对流水、蒸馏水透析,/LNaCl,+。3000rpm离心20min,将上清液上Gal-Sepharose6B亲和层析柱,,,。收集洗脱峰,透析及超滤除去半乳糖。超滤液经冷冻干燥备用。,,用BCATM试剂盒检测蛋白浓度,并配制不同浓度的ALL溶液22μg/mL>44μg/mL、220μg/mL。(PBMC):抽取健康人静脉血50ml,注入到含有肝素钠溶液的无菌采血管中缓慢摇匀,再加入等量的无菌PBS缓冲液混匀。取5ml淋巴细胞分离液加入到
15ml离心管中,将血液稀释液沿管壁缓缓叠加于分离液上,形成清晰的界面。血液稀释液与分离液的容积比例以2:1-3:1为宜,静置IOmin后,2000rpm常温离心20min。用滴管吸取单个核细胞层并置于另ー离心管中,加入2-3倍体积的红细胞裂解液,混匀,冰上静置3min,加入10倍体积的PBS缓冲液,充分混匀后,1500rpm,4°C离心5min。离心后倾弃上清液,再用PBS缓冲液洗2次。用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的的RPMI-1640培养基配制成细胞悬液,并调整细胞浓度为106/mL,于37°C,5%C02培养箱中培养2h。去除非贴壁细胞,剩下的贴壁细胞即为单核细胞。%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640继续培养PBMC,同时加入GM-CSF15ng/mL和IL_415ng/mL,每2天进行一次半量换液,第六天加入红桂木凝集素22-220μg/ml,作用48小吋。所得上层细胞即为成熟的树突状细胞。空白对照组的培养基是含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基,同时加入GM-CSF15ng/mL和IL_415ng/mL,每2天进行一次半量换液,培养8天。TNF-α对照组的培养基是含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基,同时加入GM-CSF15ng/mL和IL_415ng/mL,每2天进行一次半量换液,第六天加入TNF-a50ng/mL,作用48小时。
I所示,加入不同浓度ALL培养2天后,各组细胞均生长良好,呈不规则状态,大部分呈悬浮或半贴壁状态,细胞表面都有长短不等的突起,単独生长或聚集成较大的细胞集落,为典型的树突状细胞形态。,调整DC浓度至IX106/mL,加入Ep管,PBS洗一次,1500rpm离心5min;弃上清,残留100μL,混匀细胞,分别加入单克隆抗体⑶la、⑶83、⑶86、⑶40和HLA-DR;4°C避光反应30min,PBS洗一次,加入500μLPBS重悬细胞,流式细胞仪检测细胞的表面标志。
空白对照组和TNFα对照组的DC经同样步骤分别上流式细胞仪检测细胞的表面
O检测结果见图4,可以看出ALL能增强DC表面分子⑶Ia的表达,表明ALL在一定程度上促进单核细胞向树突状细胞的分化,同时ALL明显增强DC表面分子⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR的表达,表明ALL可促进DC成熟。,严格按照ELISA试剂盒说明书操作,分析细胞因子TNF-α和IL-12含量。检测结果见图2和图3=ALL明显促进DC分泌TNF-α和IL-12。
(I)计数实施例2中收集的DC,调浓度至lX106/ml,加入丝裂霉素C25μg/mL,37°C5%C02培养箱中培养30min。用无血清RPMI-1640
培养基洗细胞3次,再用RPMI-1640完全培养基调细胞浓度为2X106/mL。(2)按常规法分离人外周血T淋巴细胞,并用RPMI-1640完全培养基调细胞浓度至5X105/mlο(3)按DCT比例梯度1:5,1:10,1:20,1:50接种细胞至96孔圆底培养板,200μL/孔,每组设3个复孔。于37°C,5%C02培养箱中培养96h。1300rpm,5min,弃去100μL上清液,每孔加入MTT10μL(5g/L),继续培养4h,1300rpm,min弃上清液,每孔加入DMSO100μI充分溶解结晶,用Bio-Rad酶标仪检测0D570nm。检测结果见图5:DC与T淋巴细胞比例为1:5时,其促进T细胞增殖的能力最強,而且ALL浓度为44μg/mL和220μg/mL时的作用明显强于空白组,结果表明ALL能增强DC的抗原递呈能力。实施例4树突状细胞的增殖检测将PBMC调整浓度为IX106/mL,接种于96孔板。按实施例2的处理方法,培养8天后,每孔中加入CCK-8溶液10μL,继续培养2h,用Bio-Rad酶标仪检测0D450nm,计算细
胞增殖率。增殖率(%)=(实验组OD值-空白组的OD值)/空白组的OD值X100%检测结果见图6:红桂木凝集素显著促进DC的増殖,増殖率随着红桂木凝集素浓度的增加而升高。
权利要求
,其特征在于添加红桂木凝集素作为诱导树突状细胞成熟和増殖的专用培养基,是在树突状细胞培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素;所述树突状细胞培养基是含有
10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基;所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是22-220μg/mL。
,其特征在于所述的专用培养基红桂木凝集素的浓度是44μg/mL。
,其特征在于在树突状细胞培养基中加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子,培养到第6天时,カロ入红桂木凝集素,继续培养2天,制备成熟的树突状细胞;所述的前体细胞来自人外周血单个核细胞。
,其特征在于所述的诱导因子为GM-CSF和IL-4,诱导因子在加入树突状细胞的前体细胞的第一天加入,所述的GM-CSF的浓度为15ng/mL,所述的IL-4的浓度为15ng/mL。
,其特征在于所述的培养温度为37°C,CO2浓度为5%,湿度为饱和湿度,每2天换一次新鲜的培养基。
全文摘要
本发明公开了一种能体外诱导树突状细胞(DC)成熟和增殖的红桂木凝集素及其诱导DC成熟和增殖的专用培养基和制备方法。所述红桂木凝集素以红桂木种子为原料,采用常规分离方法分离纯化。所述专用培养基是是在
DC培养基中加入诱导因子和红桂木凝集素。所述的制备方法是在DC培养基中加入DC的前体细胞和诱导因子,培养到第6天时,加入红桂木凝集素,继续培养2天,制备获得成熟DC。所述前体细胞为外周血单个核细胞。所述诱导因子为GM-CSF和IL-4。本发明建立了稳定的诱导DC成熟和增殖的培养技术体系,操作简单,方便实用,所需的细胞因子少,费用低,且DC成熟度高,功能强。本发明提供的红桂木凝集素为进一步开发疫苗增强剂提供了新型有效的途径。