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专利名称:体内重组的制作方法
技术领域:
本发明涉及同源DNA序列体内重组的方法。该方法是强制性的人工进化,从而得到编码具有优越特性多肽的DNA序列。发明背景位于相同质粒上DNA序列间的同源重组对于本领域技术人员是众所周知的(Weber和Weissmann,核酸研究(1983)11,5661-5669)。EP25266Bl(NovoNordiskA/S)、WO95/22625A1(.)和WO9101087公开了位于相同质粒上基因的体内重组。
EP449923B1(Setratech)公开了部分同源DNA序列在体内基因间重组的方法。重组在缺乏酶错配修复系统的细胞中发生。
生物技术杂志(1991)19,221-240公开了用于失活解淀粉芽孢杆菌基因组中基因的方法。此方法包括pE194突变子的整合与切除。
在化学文摘118161925(1993)中,测定了重组必需的最小同源序列长度。测定方法包括整合带有葡萄糖酸酶(gluconase)基因的pE194衍生物。
在细菌学杂志(1982)152,524-526中,公开了包括金黄色葡萄球菌两个质粒pE194与pUB110的质粒pBD9。基于pE194或pUB110的其它质粒公开于分子及普通遗传学(1988),213,
465-70、分子及普通遗传学(1984),195,374-7、质粒(1981),6,67-77与遗传(Genetika),(1986)22,2750-7中。
在遗传学报(1993),20,272-8(见化学文摘1201670(1994))中,Chen等公开了质粒pNW102,一种pE194的衍生物,其中插入了地衣芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶。将pNW102转化入枯草芽孢杆菌菌株BF7658,然后在非允许的温度下孵育,使pNW102与BF7658的α-淀粉酶基因间重组。重组菌株产生的α-淀粉酶与地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶表现出相同的特征。
然而,在有关领域中还没有这样的迹象,即可通过反复整合与去整合(cross-out)体内重组DNA序列从而获得编码具有改进特征,如增加的稳定性、增强的特异性或更高的活性多肽的基因。
因此,本发明的目的是提供改进的产生新的DNA序列的体内方法。发明简述本发明涉及产生新的DNA序列的体内方法。已证明,通过包括至少两种载体(每种载体含有同源DNA序列与复制起点)之间DNA的体内交换的方法可从至少两种同源DNA序列中以快速而有效的方式产生具有改进特性的新DNA序列。
本发明的方法特征在于,所述同源序列的所述交换通过在体内重复至少一次整合与切除一种载体至另一种载体内而完成。
因此,在第一方面,本发明涉及同源DNA序列体内重组的方法,包括以下步骤(a)在利于一种DNA结构整合入另一种DNA结构中的条件下孵育含有至少两种DNA结构的细胞,其中每种DNA结构包括DNA序列与复制起点,因而形成杂交DNA结构;(b)在利于从所述杂交DNA结构中切除的条件下孵育该细胞,继而形成新的DNA结构,其中的每种DNA结构包括重组DNA序列与复制起点;(c)重复步骤a)-b)至少一次。
本发明体内重组方法的一个优势是通过DNA序列间反复体内交换使获得所述DNA序列间众多不同的重组模式成为可能。
这由这里的
图1中所示,其中显示了按实施例1中所述进行的两种DNA序列Savinase与Savisyn之间体内重组的结果。
在图1中,Savinase/、812是来自两种DNA序列间不止一次的体内重组事件。附图简述图1图示说明位于温度抗性质粒pTR(因为复制起点在50℃有功能)与温度敏感性质粒pTS(因为复制起点在高于45℃时无功能)上两种DNA序列的重组。在非允许的条件(即,于50℃)下,pTS整合入pTR,形成杂交质粒。
图2图示说明从杂交质粒中切除,形成两种新的DNA序列,每种位于一个质粒上。反复整合与切除可通过,如温度循环或简单地通过维持温度压力与筛选pTS抗性(即,ErmR)而完成。
图3图示说明经过反复整合与切除事件后而获得的质粒。
此外,图1与2图示说明适于体内杂交结构形成测定和适于从DNA杂交结构中进行强制切除的DNA结构系统。
图1DNA结构pTS指导活性蛋白表达的适当的活性启动子ErmR抗生素抗性基因DNA结构pTR包括没有指导GFP转录的任何活性启动子GFP绿色荧光蛋白pTS中的ErmR抗生素抗性基因由于活性的启动子而具有活性。
pTR中的GFP基因由于没有驱动该基因表达的活性启动子而没有活性(即,该基因不转录)。
图2形成本发明杂交结构后,GFP现在有活性(由启动子驱动)。这使在体内测定杂交结构形成成为可能(见下面进一步的细节)。
相反,由于没有驱动基因表达的活性启动子,ErmR抗生素抗性基因现在没有活性(即,该基因不转录)。DNA杂交结构的强制切除通过以下方式完成,即在ErmR抗生素压力下孵育此细胞,从而强迫DNA杂交结构的切除,因为该细胞仅在DNA结构切除发生后才能表达ErmR抗生素抗性基因。
图4与图5图示按实施例1中所述用于体内重组2个DNA序列Savrnase与Savisyn的2个载体pSX120(图4)与pMB430(图5)。
pSX120包括i)编码Savinase的开放阅读框,ii)指导Savinase转录的活性启动子,和iii)赋予对***霉素抗性的基因
(CamR)。
pMB430包括i)SavizynDN***段,ii)终止子(导致其后面的区域不转录),iii)赋予对红霉素抗性的基因(ErmR)和iv)编码绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框。
图6图示按实施例1中所述进行的Savinase/Savisyn体内重组结果。
图解显示了12个改组/重组的克隆。
水平地给出了Savizyn独特的限制性位点位置。
字母“S”表示该位置的序列与Savinase序列相同并且字母“Z”表示该序列来自Savizyn。所有测序克隆的重组模式不同。定义如这里所使用的,下面的术语具有以下的意义术语“DNA序列”包括以下任何的DNA序列,即有必要根据本发明修饰的,如编码多肽,例如酶、药物活性多肽,如胰岛素、生长素、人类激素或生长调节剂的DNA序列和序列如启动子、转录或翻译调节子及其它细胞内多核苷酸及多肽。
术语“同源”意为具有一些相同核苷酸片段的DNA序列,从而允许体内重组。DNA序列内所述片段至少15个碱基对长,更为优选地至少为25个碱基对长,甚至更为优选至少50个碱基长,并且最为优选至少为150个碱基对或更长。
术语“同源”包括60%一致到仅有一个核苷酸不同的DNA序列的片段。DNA序列片段大于70%的一致,更为优选至少80%一致,尤其优选大于90%一致性是优选的,并且更为优选
DNA序列片段95%一致,最为优选至少97%的一致。
在目的DNA序列片段内,上面所指的DNA序列同源性测定为两种序列之间的一致性程度,表明第一种序列源自第二种序列。通过本领域已知的计算机程序,如在GCG程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage,第8版,1994年8月,遗传学计算机小组,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,美国53711)(Needleman,,.,(1970),分子生物学杂志,48,443-453)可适当测定同源性。用具有下面设置的GAP进行DNA序列比较GAP新增补偿(creationpenalty)(extentionpenalty),目的同源DNA序列优选按上述显示一致性程度。
术语“重组DNA序列”意为至少两种DNA序列之间重组事件得到的DNA序列。该重组事件可以是单一的重组事件或者可以首先是至少两种DNA序列之间的重组事件,然后从不同于第一次重组事件的位点切除。
术语“DNA结构”意为DNA分子,如载体、质粒、染色体(如枯草芽孢杆菌染色体)、病毒、噬菌体、转座子或基因组。
术语“载体”意为能够含有待重组DNA序列与复制起点的任何线性或环状DNA分子。该术语包括本领域技术人员已知的任何载体,如质粒或噬菌体。该DNA序列任选但不一定在启动子控制之下。
这里与本发明体内重组方法联合使用的术语“细胞”意在同时包括“细胞”与“细胞种群”。
术语“转移”意为将DNA结构导入细胞中。可用本领域已知的直接导入DNA的技术,如通过用电穿孔、感受态细胞的转化、原生质体转化、转染、转导、缀合或轰击转化导入DNA结构。
术语“孵育”(或培养、生长)意为以这样的方式处理细胞从而正常的细胞功能,特别是对重组必需的功能是有活性的。可在固体培养基(琼脂培养皿)上培养细胞或在浸没条件下孵育细胞。在试管,如eppendorph试管中孵育细胞是优选的。在温度敏感的复制起点情况下,将试管方便地置于自动热循环仪中。此外,可在标准的摇瓶中孵育细胞。
术语“复制起点”(ori)意为开始DNA结构复制的区域。术语与复制起点联用的有功能意为复制可从该起点开始。术语无功能意为在给定条件下没有开始复制,或在适当的选择压力下复制的起始降至,如不足以使含有具有标记基因和ori的DNA结构的细胞存活的水平。
与复制起点或载体联用的术语“温度敏感”意为该载体不能够在,如增加的温度,即非允许的条件但允许母本细胞生长的条件下复制。
与复制起点或载体联用的术语“温度抗性”意为该载体能够在增加的温度下复制。
术语“DNA文库”为包括众多不同DNA序列的文库。可根据本领域已知的标准方法,如体外DNA改组/DNA重组(WO95/17413,WO95/22625)和/或易错PCR及盒式诱变制备DNA文库。
这里的DNA文库可包括少达2-20个不同的序列,如其中仅一个氨基酸被改变的文库。此外,DNA文库可众多不同的DNA序列,如,达1010个不同的序列。发明详述本发明包括用于体内重组同源DNA序列的方法,包括以下步骤(a)在一定的条件下孵育含有至少两种DNA结构的细胞,每个DNA结构包括DNA序列和复制起点,其中在此条件i)至少一个复制起点没有功能和ii)该细胞位于选择压力下,即仅允许含有具有无功能起点DNA结构的细胞生长(即,利于一种DNA结构整合入另一结构中,继而形成杂交DNA结构);(b)将所述的条件变为下面的条件,其中与步骤(a)相比较少的复制起点没有功能(即,利于从所述杂交DNA结构中切除);(c)重复步骤a)-b)至少一次。
重组DNA序列将编码具有新特性的新的多肽。然后为了选择和/或筛选由一种或更多种重组DNA序列编码的所需特性,在本发明方法中掺入选择或筛选系统是可能的。
上面步骤(c)的重复次数可以为一次重复或者可以为更多如5-10次重复或50-100次或甚至更多次数的重复。
通过在DNA结构的复制起点没有功能的条件下孵育细胞而强
制整合(或使利于该DNA结构的存活)和通过在其中的DNA结构复制起点重新有功能的条件下孵育细胞强制切除,这是优选的。
在另一个优选的实施方案中,在上面步骤(a)到(c)中描述的常规途径中,将细胞维持于发生自发整合与切除的恒定条件(如,恒定温度与选择压力)下是优选的。那就是重复在细胞中的改组方法而不反复改变条件。
在许多DNA结构中,如在许多芽孢杆菌DNA结构(载体)中(枯草芽孢杆菌和其它格兰氏阳性细菌、Sonensheim等.,1993,美国微生物学学会,华盛顿特区),复制起点包括ori(+)与ori(-)。ori(+)控制第一条DNA链复制的起始,并且ori(-)控制第二条链上复制起始点(枯草芽孢杆菌和其它格兰氏阳性细菌,Sonensheim等.,1993,美国微生物学学会,华盛顿特区)。
在本发明方法的实施方案中,至少一种DNA结构不包括ori(-)(即仅仅包括ori(+))。优选地,不包括ori(-)的DNA结构为起点(即,这里的ori(+))在根据本发明进行的杂交DNA结构形式中有功能的DNA结构。
本发明此实施方案的一个优势是仅当ori(+)在所述的DNA结构中有功能时,此DNA结构与同时包括ori(+)与ori(-)的DNA结构相比,其能以单链状态存在相对较长的时间。此延长的单链状态促进根据本发明方法的杂交DNA结构的形成。
优选地,上述不包括ori(-)的DNA结构为芽孢杆菌结构,更为优选为芽孢杆菌载体。
为了说明此概念,一个实例为不包括ori(-)的修饰的pTR(TR温度抗性)芽孢杆菌载体(见图1)。如果在50℃进行杂交形成,仅仅pTR的起点有功能(pTS(TS温度敏感)起点没有功能)(见图1,2)。DNA结构pTR仅仅包括ori(+)并且因此以单链状态存在相对更长的时间,这利于与pTSDNA结构间的重组事件和随后的杂交形成(见图1,2)。
一种DNA结构为能够在有些(允许)条件下复制而不能够在其它(不可接受)条件下复制的载体是更为优选的。例如,该载体可以为温度敏感性复制的载体。因此,该载体可以是不能够在增加的温度时复制(但该温度仍允许母本细胞生长)的载体。将此细胞开始于允许载体复制的温度孵育并且在整合入其它DNA结构可能发生后,于不允许载体复制的温度下孵育,从而除非整合,否则该载体从细胞中丢失。
此载体可进一步包括可选择的标记。此时,在不可接受温度时的孵育可在选择条件下进行以确保仅仅含有整合载体(其包括DNA序列与可选择标记)的细胞将存活。
此外,构建可能在体内测定杂合结构形成的系统是优选的。
优选地,通过构建其中的体内可筛选或可选择蛋白仅在形成杂合结构后表达的系统完成此方案。