文档介绍：该【低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶的制作方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【16】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶的制作方法
专利名称:低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶的制作方法
技术领域:
本发明属于生物工程领域,涉及基因的突变和重组技术,尤其是低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶。
背景技术:
碱性蛋白酶()是一种在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类,-,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,被广泛应用于洗涤剂、食品、化妆品、水产饲料、制革、纺织以及医药等领域。
碱性蛋白酶在碱性条件下具有较好的催化蛋白质肽键水解的能力,-,因此,碱性蛋白酶己经作为添加剂广泛应用于洗涤剂行业。添加碱性蛋白酶后的洗涤剂具有更好的去污效果,能够大大縮短洗涤时间,提高洗涤效率,可防止蛋白质污渍再次沉积在织物上,起到增白作用。Rohm于1913年最早提出将碱性蛋白酶添加入洗涤剂中,在20世纪60年代,市场上出现了第一种添加了来源于^^7/w//dew/w7m;y蛋白酶的洗涤剂。目前,碱性蛋白酶的销售额约占世界酶制剂市场的25%,在
欧洲加酶洗衣粉的比例则达到80%左右。
碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中,其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入,几乎所有的商业化碱性蛋白酶均来源于芽孢杆菌属。芽孢杆菌碱性蛋白酶的最适作用温度为60'C,欧洲人洗衣通常先用40-6(TC热水浸泡,其中的碱性蛋白酶可充分发挥作用,而40-6(TC的洗涤温度需要给水加热,会产生较大的能源浪费,在亚洲特别是发展中国家****惯用自来水洗衣,而碱性蛋白酶在较低的温度下又无法发挥最大的酶活力,使洗涤剂不能充分发挥其洗衣效力,因此有必要开发一种最适温度为低温的碱性蛋白酶。
利用诱变剂对产酶菌株进行诱变处理等传统的工业微生物育种方法,简单可行,但工作量大,且很难筛选到符合工业生产要求的理想菌株。对酶蛋白从分子水平进行定向改造是近年来发展起来的一种新方法,酶的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶出发,利用error-pronePCR、DNAshuffling等技术,经过基因的突变和重组,构建一个突变酶文库,通过筛选最终获得具有某些特性的酶基因。国内外已有很多利用定向进化技术对酶进行改造的相关报道。酶的定向进化不需准确的酶分子的结构信息,而是通过随机突变、基因重组、定向筛选等方法对其进行改造,具有较强的实用性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种利用error-pronePCR、DNAshuffling方法对嗜碱芽孢杆菌成熟肽基因进行定向改造获得的一种低温碱性蛋白酶基因、
采用该基因构建和筛选得到了一种产低温碱性蛋白酶的工程菌以及含有该基因的低温碱
性蛋白酶。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种低温碱性蛋白酶基因,,序列特征为810bp,核酸,单链,线性,DNA。
而且,所述基因的源基因是从嗜碱芽孢杆菌(^"7/wa/ca/oi^^ATCC21522)中
获得的。
一种低温碱性蛋白酶基因的构建方法,构建的歩骤是
a)碱性蛋白酶成熟肽基因的获得;
(2)碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造,以获得具有不同特性的碱性蛋白酶的基因文
库;
(3)表达载体构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选;
(4)筛选得到目的菌株后进行测序,得到该基因序列。
一种含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌,该工程菌具有产低温碱性蛋白酶的特性。一种产低温碱性蛋白酶工程菌的构建方法,步骤包括
(1)碱性蛋白酶成熟肽基因的获得;
(2)碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造,以获得具有不同特性的碱性蛋白酶基因文库;
(3)表达载体构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选。
而且,所述歩骤(2)中碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造方法采用error-pronePCR和DNAshuffling。
而且,所述步骤(3)中表达载体为pBE2R,pBE2R是一种大肠-枯草穿梭分泌表达型载体,含有一个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录,一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌至胞外。
而且,所述步骤(3)中构建工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌Sad//^w^"fcWB600,该菌为6种胞外蛋白酶缺失菌株。
一种产低温碱性蛋白酶工程菌发酵生产的低温碱性蛋白酶,,最适作用温度为3(TC,。
本发明的优点和积极效果是
1、本发明涉及的工程菌所产碱性蛋白酶在25-35t:均具有较高活性,其最适温度为30°C,,由此可知该酶在较低温度的碱性条件下均具有较高活性,解决了现有技术中较高作用温度引起的能源浪费的问题,使用该酶开发的洗漆剂更加适合亚洲特
别是发展中国家的洗衣****惯,节约能源的同时减少温室气体排放量。
2、本发明利用error-pronePCR、DNAshuffling对嗜碱芽孢杆菌成熟肽基因进行改造,与质粒pBE2R连接,//DH5a,阳性转化子经提取质粒转化Sa"7/附w6rttoWB600构建基因突变文库,从中筛选出一株产低温碱性蛋白酶的基因工程菌;该菌株通过发酵、分离得到的低温碱性蛋白酶,为洗涤剂中添加使用的低温碱性蛋白酶提供了理论基础,具有重要的经济效益和社会效益。
图l为本发明碱性蛋白酶成熟肽基因"p,N)的PCR电泳图2为本发明error-pronePCR扩增的碱性蛋白酶成熟肽基因(qprN)的电泳图3为本发明重组表达载体pBE2R-a/^N的构建及定向进化示意图4为本发明碱性蛋白酶成熟肽基因fl^N的DNAshuffling过程示意图5为本发明碱性蛋白酶最适作用pH;
图6为本发明野生型碱性蛋白酶、突变后碱性蛋白酶最适作用温度示意图,其中□
为野生型,A为突变型。
具体实施例方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。实施例
1、碱性蛋白酶成熟肽基因aprN的获得
(1)嗜碱芽孢杆菌(&a7/Ma/m/o/Mw5ATCC21522)的培养及染色体DNA的提取挑取嗜碱芽孢杆菌单菌落接入LB液体试管中,培养温度为37'C,摇床转速为180r/min,培养时间为12h,用生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取嗜碱芽孢杆菌的染色体基因组。
(2)碱性蛋白酶成熟肽基因的获得参照NCBI上报道的碱性蛋白酶成熟肽基因(a,N),(序列号M65086)设计引物
上游引物P1:5,-TCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTG-3,(下划线部分引入7VcoI酶切位点)
下游引物P2:5,-AAAAGGATCCTTAGCGTGTTGCCGCTTCTGCATTG-3,(下划线部分引入SflwHI酶切位点)
以嗜碱芽孢杆菌染色体DNA(10ng)为模板,PCR反应体系为ddH2O20(^l,^1,dNTPlpl,上下游引物(lOpmol/pl),模板10ng,Ta《。扩增条件为94。C预变性lmin;94。C变性30s,55。C退火30s,72。C延伸lmin,反应30个循环;72°C延伸5min。PCR产物(印rN)经琼脂糖凝胶电泳检测,在约810bp处出现特异性条带,结果如附图l所示,其大小与NCBI上报道的吻合。
52、采用error-pronePCR、DNAshuffling对a;rN的定向改造
(1)error-pronePCR对a;7rN的随机突变
将PCR扩增得到的产物经琼脂糖凝胶回收,适当稀释作为error-pronePCR的模板。采用50^1的反应体系ddH204pl,10xbuffer5^x1,MgCl2(25mM)14pl,MnCl2(10mM)3pl'dATP(10mM)lpl,dGTP(10mM)1pl,dCTP(10mM)5pl,dTTP(10mM)5nl,上游引物
(10pmol尔l),下游引物(10pmolVl),DNA模板10ng,ra《。PCR扩增条件94。C预变性lmin;94。C变性30s,5(TC退火30s,72。C延伸lmin,反应30个循环;72°C延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,在约810bp处出现特异性条带,结果如附图2所示。将error-pronePCR产物和大肠-枯草穿梭质粒pBE2R分别用jVcoI和&mffl双酶切,酶切产物用DN***(TaKaRa)纯化回收,
(TaKaRa)16。C连接6h,形成连接质粒pBE2R-aj^N。
(2)
从Aa^'DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mlLB液体培养基的试管中,37'C振荡培养过夜。,37。,
将菌液转移到50ml离心管中,冰浴10min。4000r/min离心10min,回收细胞。倒出培养液,,冰浴30min。4°C、4000r/min离心10min,回收细胞,,每20(^1—份分装细胞,此细胞为感受态细胞。向20(^1感受态细胞中加入质粒DNA(即连接质粒pBE2R-a/rN)l貼,冰浴30min,然后42。C水浴保温90s,冰浴2min,加入80(^1LB液体培养基,37'C慢摇lh,涂布含有氨苄青霉素(100pg/ml)的LB平板,37。C培养12-16h。收集平板上长出的菌落于5mlLB液体培养基试管中(含有100pg/ml氨苄青霉素),37。C振荡培养,采用生工生物工程(上海)有限公司小量质粒提取试剂盒提取质粒,得到大量扩增的连接质粒pBE2R-";^N,用于转化枯草芽孢杆菌Baci//^WB600。
(3)枯草芽孢杆菌万""7/附sw6"/hWB600的转化
挑取新鲜的枯草芽孢杆菌S"c///^WB600单菌落至3mlSPI培养基中,37°C、250
r/min培养过夜。次日取100tU培养液转接至5mlSPI培养基,37°C、250r/min培养至对数生长末期(OD,),,37°C、150r/min培养90min。,加入l吗质粒(即连接质粒pBE2R-"j^N),再于37。C、100r/min振荡培养
30min,然后250r/min培养90min,得到转化子,离心倾去部分上清液,保留100pl上清液与菌液混合均匀后涂布筛选平板,通过卡那霉素抗性平板筛选转化子。
(4)突变文库的筛选
具有不同特性碱性蛋白酶基因的筛选用无菌牙签将转化子和对照菌枯草芽孢杆菌Sac/〃MWB600-pBE2R点种在含l。/o脱脂乳的LB平板(含30昭/ml卡那霉素)上,
5(TC培养12-16h。将平板上长出并产生蛋白水解圈的转化子采用96孔板高通量复筛,复筛底物为N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(AAPF)。将平板上用于复筛的单细胞克隆接入5ml2xYT液体培养基试管中(含有30吗/ml卡那霉素),于37。C、180rpm过夜培养。发酵液离心,取10W上清液,100pl含50mMTris-HCl,10mMCaCl2,100mMNaCl,(),5(TC反应lmin,加入10(^1苯***磺酰***终止酶活,于410nm检测产物的吸收值。选择将底物AAPF转化成产物能力高的转化子用于下一轮error-pronePCR。
重复2轮步骤(1)(2)(3),其中第二轮转化子和对照菌枯草芽孢杆菌Sfl"7/ww^/foWB600-pBE2R培养的温度降至45。C,第三轮转化子和对照菌枯草芽孢杆菌^^7/wwto'foWB600-pBE2R培养温度降至4(TC,过程示意图见附图3。
(5)DNAshuffling
将筛选到的具有不同特性的碱性蛋白酶基因各3ng混合,用DNaseI片段化,采用50pl体系ddH208pl,10xDNaseIbuffer5(il,DNA各3ng,,将上述反应体系于15'C反应20min,于85'C水浴中保温30min,以终止DNaseI酶活。于2%琼脂糖凝胶电泳检测片段化产物,结果见附图4。将DNaseI片段化的产物用DN***(TaKaRa)纯化回收作为无引物PCR的模板。
无引物PCR的反应体系为ddH2021pl,,dNTPlpl,模板10ng,。无引物PCR扩增程序94'C预变性lmin,94'C变性30s、(TC退火30s、72'C延伸90s、反应50个循环,72'C延伸5min。将无引物PCR产物稀释1(^倍,作为有引物PCR的模板。
有引物PCR反应体系为5(Hil:ddH2039pl、10xbuffer5pl、dNTP2pl、上游引物(10pmol尔l)1^1、下游引物(10pmol/pl)1^1、模板10ng、7b《。PCR扩增程序94。C预变性lmin,94。C变性30s、57。C退火30s、72。C延伸90s、反应30个循环,72。C延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,在约810bp处出现特异性条带。片段化过程及两歩骤PCR过程的电泳图如附图4所示。
3、表达载体的构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建和筛选
(1)将有引物PCR产物纯化回收后,用脸oI和SamHI双酶切,酶切产物与质粒