以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇的制作方法.docx

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专利名称:以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇的制作方法
以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇相关申请的交叉引用本申请要求于2009年6月30日提交的临时申请第61/221,934号和于2010年3月18日提交的临时申请第61/315,380号的权益,其全部内容通过引用并入本文。.§、经由文件名CX3-017US-(CRF)以电子方式同时提交的“序列表”通过引用并入本文。2010年6月28日创建了序列表的电子副本,且磁盘上的大小为82Kb。背景柴油燃料是用于柴油机的任何燃料,并包括石油柴油和生物柴油二者。石油柴油是化石燃料油的特定分馏物。其包括约75%的饱和烃类和25%的芳香烃类。生物柴油不是来源于石油而是来源于植物油或动物脂肪并包含长链烷基酯类。生物柴油通过脂质(例如,来自油炸锅的用过的植物油或种子油)与醇的酯交换而生成,且比石油柴油燃烧更清洁。生物柴油可单独使用或以任何量与石油柴油混合使用以用于现代发动机。煤油是可燃的烃,其也是化石燃料的特定分馏物,且包含具有6至16个碳原子的烃类。煤油具有与石油柴油相当的燃烧热,且广泛用于喷气燃料中以为喷气发动机提供动力和在某些国家用于供暖。基于煤油的燃料也可利用液态氧来燃烧并用作火箭燃料
(例如,RP-1)。对石油衍生的燃料的依赖已使自然资源的供给枯竭且需要更多依赖于进口的汽油和柴油产品。此外,石油基燃料的燃烧增加了大气中温室气体(例如,二氧化碳和甲烷)的量,这助长了地球气候的逐渐变暖。燃料,比如生物柴油,由动物产物或植物产物制成,比石油衍生的燃料燃烧更清洁,且不产生温室气体的净增量。并且,它们是可持续能源并可能减少美国对进口石油基产品的依赖。然而,存在着使用土地来生产燃料作物而非粮食作物将促使世界饥饿的担心。脂肪酸是细胞膜的主要成分,且几乎所有生物体将其用作能量贮存的主要来源。脂肪醇是脂肪酸的还原产物,并且和脂肪酸一样可由培养的细胞酶促产生。可将脂肪醇与酸反应以形成与生物柴油燃料中存在的酯组合物相似的酯组合物,或可将脂肪醇还原以形成类煤油(kerosene-like)组合物,或与石油柴油相似的烃组合物。将脂肪酰硫酯底物(例如,脂肪酰CoA或脂肪酰ACP)转化为脂肪醇的酶常称作脂肪醇形成酰基CoA还原酶或脂肪酰还原酶(“FAR”)。PCT公布WO2007/136762公开了用于产生脂肪酸衍生物的遗传工程化的微生物和它们的使用方法。PCT公布WO2009/140695公开了包括编码参与烃生物合成的酶的蓝细菌基因的组合物和将它们用于产生醛类和醇类的方法。Steen等人.,2010,Nature463:559_563公开了大肠杆菌()的工程化以直接从单糖产生特定的脂肪醇酯
(fattyester)、脂肪醇和蜡类。Schirmer,2009,CurrentOpinioninMicrobiology12:274_281描述了用于产生类燃料分子的异养微生物的发酵代谢和非发酵代谢,将代谢中间体转化为类燃料分子的生物催化剂,和决定所述类燃料分子的具成本效益的产生的参数。美国专利第5,370,996号和Metz等人(2000)PlantPhysiologyl22:635_644公开了来自较常称作荷荷巴(jojoba)的荒漠灌丛希蒙得木(Simmondsiachinensis)的脂肪酰还原酶(FAR)酶的分离和表征。Moto等人(2003)'(16):9156_9161公开了来自蚕蛾家蚕(Bombyxmori)的FAR酶的分离和表征。Reiser等人(1997)(9):2969_2975公开了来自产赌酯细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)的脂肪酰CoA还原酶的分离和表征,该酶将具有从C14到C22的链长度的脂肪酰CoA底物还原为相应的脂肪醛,需要脱氢酶以将脂肪醛转化为脂肪醇。理论上,这些FAR酶可在异源宿主中表达,作为产生用于生物燃料的非石油基的、可再生来源的脂肪醇或衍生组合物的手段。然而,当在诸如大肠杆菌和酵母的异源宿主中表达时,所获得的脂肪醇的产量不足以用于某些应用。此外,产生的脂肪醇至多仅小部分被微生物分泌,这大大增加了纯化的成本。因此,本领域中对于诸如FAR酶的酶仍存在需求,所述酶可用于有效地产生脂肪醇以用于工业应用,所述工业应用诸如但不限于在食品工业、化妆品工业、医药工业和燃料工业中的应用。概述本公开内容提供分离的脂肪酰还原酶
(FAR)酶、编码FAR酶的核酸、被工程化以表达FAR酶的重组微生物、利用FAR酶和/或重组微生物产生脂肪醇和其他组合物的方法,和包括脂肪醇和/或衍生自脂肪醇的组合物。本文描述的多个发明部分地基于发明人的令人惊奇的发现在海水中发现的Y蛋白菌的种类的某些属包含FAR酶,当所述FAR酶在异源细胞中表达时能够产生高产量的总脂肪醇和分泌的脂肪醇。特别地,本发明人已发现海杆菌属(Marinobacter)物种栖藻(algicola)海杆菌(菌株DG893)(“FAR_Maa,,)、水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)VT8(“FAR_Maq,,)、和海洋杆菌属(Oceanobacter)物种菌株RED65(最近重分类为BermanellamarisrubriRED65)("FAR_0cs")分别具有当在大肠杆菌宿主中表达时,能够比来自家蚕的FAR酶产生多约150-400倍的总脂肪醇的FAR酶。在酵母中也获得了显著较高的脂肪醇的产量。基于该令人惊奇的发现,预期海洋细菌的其他属且尤其是海洋Y蛋白菌将同样地包含FAR酶,特别当所述FAR酶在异源宿主微生物中表达时,特别地适宜于产生脂肪醇。在某些实施方案中,利用隐马尔可夫模型(“HMM”)可鉴定特别适宜于产生脂肪醇的FAR酶,所述隐马尔可夫模型通过与发现于预编译(pre-complied)组的蛋白序列的类型的相似性来鉴定蛋白。HMM中囊括了每个预编译组中的固有的类型。对于给定的序列组,
HMM界定蛋白结构域或蛋白家族。使用该技术可能将与先前鉴定的适宜的FAR酶共有共同结构域的给定蛋白序列的部分进行分类。参见,例如,。在某些实施方案中,HMM被用来鉴定NAD结合结构域和/或不育结构域。因此,在一方面,本公开内容提供来源于或获自海洋细菌诸如海洋Y蛋白菌的分离的FAR酶和/或其具有FAR活性的功能片段。在一些实施方案中,FAR酶直接分离自其天然存在于其中的海洋Y蛋白菌。在一些实施方案中,FAR酶和/或功能片段分离自经工程化以表达FAR酶或功能片段的异源宿主微生物。在另一方面,本发明涉及来源于或获自栖藻海杆菌菌株DG893的FAR酶和其功能片段。在一个实施方案中,FAR酶或其功能片段具有与SEQIDNO:2或其功能片段至少30%相同、至少75%相同、至少80%相同和至少90%相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中,分离的FAR酶具有与SEQIDNO:2相同的氨基酸序列。在又一方面,本发明涉及来源于或获自海洋杆菌属的菌株的FAR酶和其功能片段。在一个特定的实施方案中,FAR酶获自或来源于海洋杆菌属物种菌株RED65并具有与SEQIDNO:6至少30%相同、至少75%相同、至少80%相同、和至少90%相同的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中,分离的FAR酶具有与SEQIDNO:6相同的氨基酸序列。在再一方面,本公开内容提供编码如上所述的海洋
Y蛋白菌FAR酶或其功能片段的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA或RNA,且可以是单链的或双链的。其可分离自天然存在的微生物,或完全或部分地经由合成方法制备。在一个实施方案中,核酸序列编码包括与SEQIDN0:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO14或其功能片段具有至少30%的序列同一性的氨基酸序列的脂肪酰CoA还原酶(FAR)酶。在另外的实施方案中,核酸编码包括与SEQIDNO2,SEQIDN0:6、SEQIDNO:14或其功能片段的至少75%的序列同一性(S卩,至少75%、至少80%、至少85%、至少90%和甚至至少100%的序列同一性)的FAR酶。在本方面的一些实施方案中,载体包括编码FAR酶的核酸。在一些实施方案中,编码FAR酶或其功能片段的多核苷酸与启动子可操作地连接,且任选地与控制表达的其他控制序列和元件可操作地连接。在一些实施方案中,设计或选择载体以保持与宿主微生物的基因组区分开(例如,质粒),或以通过诸如同源重组或位点特异性整合而整合入宿主微生物的基因组中。在特定的实施方案中,将编码FAR酶或功能片段的构建体部分的密码子进行优化以用于在特定的宿主微生物中表达。在另一方面,本公开内容提供被工程化以表达如本文描述的异源的海洋、蛋白菌FAR基因或其功能片段的重组微生物。在一些实施方案中,重组宿主细胞包括细菌、丝状真菌和酵母。在特定的实施方案中,细菌是大肠杆菌。在另外特定的实施方案中,酵母是产油酵母。在某些实施方案中,产油酵母是解脂耶罗威亚酵母
(^。在又一些另外的实施方案中,酵母是酿酒酵母()。在某些方面,微生物是野生型微生物。在另外的方面,微生物是经遗传修饰的。在某些特定的实施方案中,经遗传修饰的微生物还过表达编码提高微生物产生FAR酶的底物的速率的蛋白的基因,所述FAR酶的底物即,脂肪酰硫酯底物。在某些实施方案中,由过表达的基因编码的酶直接参与脂肪酸合成。在特定的实施方案中,由过表达的基因编码的酶选自脂肪酸合酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酰CoA合酶和乙酰CoA羧化酶。在一些实施方案中,由过表达的基因编码的蛋白对于微生物是内源性的。在另外的实施方案中,由过表达的基因编码的蛋白对于微生物是异源性的。在又一方面,本公开内容提供产生包括脂肪醇和/或衍生自脂肪醇的酸酯和/或烷烃和/或烯烃的组合物的方法。在某些实施方案中,脂肪醇在无细胞的系统中产生,其中提供如上所述的FAR酶和脂肪酰硫酯底物和必需的辅因子,在温度、pH和离子强度的适宜条件下持续足以产生脂肪醇的时间。在各种实施方案中,脂肪醇由包括编码如上所述的FAR
7酶的异源基因的重组宿主细胞产生。在这些实施方案中,在适宜于产生脂肪醇的条件下将宿主细胞培养于包括可同化碳源的含水营养培养基(aqueousnutrientmedium)中。在某些特定的实施方案中,重组宿主细胞是细菌或酵母。在各种实施方案中,酵母是产油酵母。
在特定的实施方案中,细菌是大肠杆菌且酵母选自酿酒酵母和解脂耶罗威亚酵母。在一些实施方案中,脂肪醇由包括编码FAR酶的异源基因和提高重组宿主细胞产生FAR的酰基硫酯底物的速率的一种或多种蛋白的重组宿主细胞来产生。在一些实施方案中,所述一种或多种蛋白直接参与脂肪酸生物合成。在某些特定的实施方案中,所述一种或多种蛋白选自脂肪酸合酶、酰基ACP硫酯酶、脂肪酰CoA合酶和乙酰CoA羧化酶。在一些方面,由重组微生物产生的脂肪醇从细胞分泌到含水营养培养基中。在某些实施方案中,本文描述的方法包括分离脂肪醇的步骤。在另一方面,本发明涉及产生脂肪醇组合物的方法,所述方法包括在适宜的培养基中培养重组微生物,其中重组微生物包括编码与SEQIDN0:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:14或其功能片段具有至少30%的序列同一性的异源脂肪酰还原酶(FAR)酶的基因,并允许所述基因的表达,其中所述表达导致脂肪醇组合物的产生。在本方面的一些实施方案中,方法还包括分离产生的脂肪醇。在特定的实施方案中,,以及至少5g/L和甚至至少15g/L的脂肪醇。在又一方面,本发明涉及通过酰基CoA非依赖途径产生脂肪醇组合物的方法,所述方法包括在适宜的条件下在营养培养基中培养重组大肠杆菌,其中所述重组大肠杆菌包括编码包括与
SEQIDN0:2、SEQIDNO:6、SEQIDNO:14或其功能片段具有至少75%(比如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%和甚至100%)序列同一性的氨基酸序列的异源脂肪酰CoA还原酶(FAR)酶的核酸序列;允许所述FAR的表达;和产生脂肪醇组合物。在再一方面,经工程化以表达本发明涵盖的FAR的重组微生物是包括失活的或沉默的内源脂肪酰CoA合成酶fadD基因的细菌,尤其是大肠杆菌。在另外的实施方案中,重组大肠杆菌将包括失活的或沉默的内源短链脂肪酰CoA合成酶fadK基因。在另一些另外的实施方案中,两个基因将都是失活的或沉默的。在又一方面,本公开内容提供通过以上描述的方法产生的脂肪醇组合物。在一些实施方案中,脂肪醇组合物在无细胞的系统中产生。在另外的实施方案中,脂肪醇组合物由重组宿主细胞来产生。在特定的实施方案中,组合物包括具有饱和的、不饱和的、直链的、支链的或环状的烃链的脂肪醇。在某些实施方案中,组合物包括饱和的脂肪醇和/或单不饱和的脂肪醇。在又一些另外的方面,本公开内容提供包括通过还原本文描述的脂肪醇组合物衍生的烷烃和/或烯烃的组合物。在某些实施方案中,还原反应用化学方法来进行。在另外的实施方案中,还原反应利用具有用于还原脂肪醇的生物合成途径的微生物来进行。在某些实施方案中,通过还原脂肪醇产生的组合物基本上包括所有烷烃和
/或烯烃。在另外的实施方案中,组合物包括脂肪醇和从其衍生的烷烃和/或烯烃的混合物。在又一方面,本公开内容提供燃料组合物,所述燃料组合物包括脂肪醇和/或从其衍生的酸酯和/或烷烃和/或烯烃。在一些实施方案中,通过以上描述的方法产生的脂肪醇组合物直接用于燃料组合物中。在各种实施方案中,将脂肪醇与羧酸反应以产生用作生物柴油燃料组合物的酸酯。在另外的实施方案中,将脂肪醇与还原剂反应以产生烷烃和/或烯烃。在某些实施方案中,脂肪醇经历酯化作用以形成脂肪醇酯。在一些实施方案中,衍生自脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃用作喷气燃料组合物的组分。在其他实施方案中,衍生的烷烃和/或烯烃用作火箭燃料的组分。在另外的实施方案中,衍生自脂肪醇组合物的烷烃和/或烯烃用作类石油柴油燃料组合物的组分。附图简述
图1显示含有编码潮霉素(HygB)抗性和FAR表达的盒(cassette)的复制型解脂耶罗威亚酵母载体PCEN411(约9065bp)。ArslS是分离自解脂耶罗威亚酵母染色体DNA的自主复制序列。图2显示编码栖藻海杆菌菌株DG893的FAR酶的密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDNO:1),所述FAR酶具有图6中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图3显示编码栖藻海杆菌菌株DG893的FAR酶且为在解脂耶罗威亚酵母中表达而被优化的密码子优化的多核苷酸序列(SEQIDN0:3),所述