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专利名称:以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺的制作方法
技术领域:
本发明涉及生物医药领域,特别是以猪小肠为原料生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺,可广泛用于生化试剂和生物医药。
背景技术:
(1)碱性磷酸酶(Alklinephosphatase,,简称ALP或AKP)广泛存在于人体、动物、植物及微生物体内,在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程,对体内钙磷的吸收与代谢、维持体内适宜的钙磷比例起重要作用。碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶,能水解磷酸单酯键,但不水解磷酸二酯键。它可作用于多类底物,如β-甘油磷酸、葡萄糖-1-磷酸,腺苷磷酸、尿苷磷酸和5-磷酸核黄素等。Mg2+、Zn2+是酶的激活剂;Zn2+可能与酶的结构和酶的催化活性有关。其他激活剂如氨基醇等;抑制剂有无机磷、乙醇***等。其最适pH10左右,即在碱性条件下有较高的活性,碱性磷酸酯由此得名。
碱性磷酸酶可分别由人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织产生并经肝脏向胆外排出,但它不是单一的酶,而是一组同功酶。各器官的
ALP理化性质有些差异,在病理时还可能出现高分子ALP,以及一些和肿瘤有关的变异ALP,但各种碱性磷酸酶的氨基酸结构类似,抗原性无差别,这些酶电泳速率和对不同抑制剂反应差异来自ALP中所含糖基的不同。
高纯度的碱性磷酸酶广泛应用于生物学研究和生物技术领域,除用于酶法分析(包括酶试剂盒、酶联免疫、酶标基因探针、酶传感器等等)外,也用于生物技术中核酸的水解,如32P标记5’-末端之前用碱性磷酸酶去除RNA或DNA的5’-磷酸,去除基因工程中载体、DN***段的5’-磷酸以防止自身环化等。
(2)肝素是一类糖***聚糖,由糖醛酸和葡萄糖***以1→4键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物。含10-30个二糖单位不等,分子量4000-20000,平均分子量12000。肝素的结构较复杂,一般认为它是由α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯、N-磺基-α-D-氨基葡萄6-硫酸酯、β-D-葡萄醛酸和N-磺基-α-D-氨基葡萄糖-6-硫酸酯以糖苷键结合成“四糖”作为结构单元,再由“四糖”聚合成多糖,从而使得肝素的整个结构变得异常复杂,到目前为止,肝素的精确结构还不清楚。肝素钠属高分子化合物,由分子量不同的酸性粘多精相混合的硫酸氨基多糖的钠盐,白色粉末,可溶于水,不易溶于乙醉和***等有机溶剂。
自从1937年肝素在临床上用作抗凝剂以来,肝素一直是一种主要的抗凝药物。近年来还发现肝素具有抑制平滑肌细胞增殖,抗炎症,抗肿瘤及抗病毒等生物学功能。由于肝素钠是由生物体中提取出来的天然物质,不是化学合成的产品,无副
作用,在临床使用中受到医生和患者的青睐,广泛用于防治各种脑血管疾病,阻止凝血醉原转变成纤维蛋白单体,防止血小板的集聚和破坏,治疗突发性血栓栓塞性疾病、动脉硬化和降低胆固醉,防止癌细胞的转移病变都有确切的疗效。以高纯度的肝素生产的低分子肝素(钠)产品也具有显著的治疗作用。
肝素钠在医药临床应用的不断普及和扩大,市场需求量也在不断的增加。2006年的出口统计数据显示,,创下近3年来的新高。而据业内人士预测,我国2007出口肝素钠总量将达到130-150吨。目前世界市场肝素钠原料药总销售额估计在20亿-25亿美元,年增长率大约为10%。自上世纪80年代开始,通过化学修饰肝素钠分子,研制出了治疗和预防血栓的低分子肝素。低分子肝素是肝素的部分降解物,其功能更强大,安全性更高。低分子肝素的生产也需要较高纯度的肝素。与此同时,随着市场竞争的加剧,对肝素钠的质量要求也越来越高。以往传统的提取生产工艺方法必须进一步改进和完善,既可降低肝素的生产成本,又能使肝素适合用于加工成低分子肝素。本发明则可满足上述要求。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术的状况而发明的一种以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺,该联产工艺适合于工业化生产,既能提取碱性磷酸酶,也能提取精制肝素钠,有利于实现原料的综合利用,降低生产成本,减少下脚料对环境的污染。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明的以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺,包括以下步骤①将猪小肠打浆粉碎;②***化镁、***化钠和***化锌的Tris-HCl缓冲液萃取;③正丁醇沉淀;④压滤或离心分离;⑤步骤④中分离出的上清液用***沉淀,再依此通过复溶离子交换色谱分离、真空浓缩、凝胶色谱分离、真空浓缩、冷冻干燥即得碱性磷酸酶产品;⑥步骤④中分离出的滤渣通过浸提、酶解、过滤、离子交换树脂吸附、洗涤去杂质、洗脱得到肝素、再经醇沉淀脱水干燥得粗品肝素钠、双氧水处理、过滤、滤液用乙醇沉淀、沉淀物用***脱水干燥即得精品肝素钠。
在本发明中,所用Tris-***化镁-***化钠-***化锌。
在本发明的步骤⑤中,所述复溶离子交换色谱分离所用的交换柱为DEAESepharose4B柱(×100cm),每次加样量为30ml;所述凝胶色谱分离所用的层析柱为SephadexG-150
。
在本发明的步骤⑥中,所述的酶解过程是通过加入新鲜猪胰浆或商品胰蛋白酶实现的,所用的离子交换树脂为D-204大孔吸附树脂。
本发明步骤⑥中的两次过滤所得的滤渣经干燥即为蛋白饲料。
在本发明中,步骤⑤的具体过程也就是碱性磷酸酶的分离和纯化过程为在经过前述的①②③④步骤之后,再实施以下工艺步骤a、在滤液中加入等体积冷***,混匀后于转速3000-6000r/min下离心10-20min,弃去上清液;b、向沉淀中加入约3-5倍量(W/V)-HCl缓冲液(,***化镁-***化钠-***化锌),充分搅拌使其溶解即为所得碱性磷酸酶粗酶液;c、-HCl缓冲液(,***化镁-***化钠-***化锌)平衡过的DEAESepharose4B柱(×100cm)中,每次加样量为30ml,()洗脱,其中含NaCl浓度由0至1mol/L的直线梯度洗脱,,部分收集,每管收集4mL,用280nm检测洗脱峰,用磷酸苯二钠为底物检测洗脱峰的酶活力,并将有活力的洗脱峰合并;d、将合并的活性洗脱液用旋转薄膜蒸发器于35℃以下真空浓缩,使其中蛋白质的浓度达到约
1%;e、将酶蛋白浓缩液加进SephadexG-150凝胶过滤柱层析(×100cm),采用恒压装置,(,),,部分收集,每管体积约4mL。用280nm检测洗脱峰,用磷酸苯二钠为底物检测洗脱峰的酶活力,并将有活力的洗脱峰合并;f、将合并的活性洗脱液用旋转薄膜蒸发器于35℃以下真空浓缩,当其中蛋白质的浓度达到约1%时冷冻后,采用真空冷冻干燥方法得到碱性磷酸酶粉剂。
在本发明中,步骤⑥的具体过程也就是肝素的提取和精制过程为在经过前述的①②③④步骤之后,再实施以下工艺步骤a、将滤渣放入水解锅中,按1∶3-%***化钠溶液,,加热至50-60℃,保温2-3小时,;b、-,温度调整为37-40℃,-%已经绞碎的新鲜猪胰桨,%商品胰蛋白酶,搅拌条件下保温水解3-4小时,并通过加入10%的氢氧化钠溶液保持该pH的稳定。
c、过滤酶解结束后,用10%-,,然后升温至90-95℃,搅拌条件下加入***化钠至5%,并保温30min,趁热过滤除去不溶性杂质。滤渣再用5%的***化钠溶液滤液洗涤一次,合并滤液即为肝素粗提液。滤渣用于动物蛋白饲料
。
d、离子交换树脂吸附将肝素粗提液冷却到10℃左右,静置后除去可能出现的表面凝固层,然后加热至40-45℃,-,缓慢搅拌条件下加入D-204大孔吸附树脂中,-%,吸附时间为3-5小时。然后,用尼龙布袋滤掉液体,收集树脂(有肝素吸附)。
e、洗涤用水反复冲洗吸附后的树脂,直到冲洗液变清为止。
f、洗脱先用3-4%的***化钠溶液洗涤除去部分杂质;再用12-15%***化钠溶液洗涤除去硫酸皮肤素;最后树脂浸泡到25-30%的***化钠溶液中,并轻轻搅动5-8小时后,过滤,并用该***化钠溶液重新洗涤一次树脂,合并收集滤液。
g、醇沉淀在聚搅拌下往滤液中加入乙醇,使其终浓度达到40-45%,静置3-5小时后虹吸上层醇溶液(乙醇可回收利用),取沉淀部分,用约2倍1%***化钠溶液复溶后,用乙醇二次沉淀5-8小时,h、脱水干燥沉淀物用2倍量的95%或无水乙醇脱水二次,再用***脱水一次,滤干,50℃以下真空干燥箱中慢慢干燥。此时,肝素钠的效价可在90USPu/mg以上。
i、%的***化钠配制成10%溶液,用盐酸调整pH1-2,迅速过滤,上清液再用氢氧化钠溶液调整到pH10-12,%量加入30%双氧水,于25℃下放置40小时以上,其间维持pH10-12,然后过滤并收集滤液,j
、滤液用稀盐酸调整pH6-7后,加入等量的无水乙醇,轻轻搅匀后静置12小时以上,取沉淀部分,并用***脱水后干燥,即为精品肝素钠。
本发明的创新点如下(1)本发明工艺可以使原材料猪小肠得到有效利用,既能提取碱性磷酸酶,也能提取精制肝素钠,有利于实现原料的综合利用,降低生产成本,减少下脚料对环境的污染。
(2)有多篇资料介绍碱性磷酸酶的分离纯化方法及其性质,研究材料为各种动植物和微生物。但这些研究均是在实验室水平下进行,原材料处理量少,不适合于工业化生产。本发明根据工业规模生产的实际情况,在前人研究的基础上综合各种方法的优点,采用了与目前文献报道不同的工艺路线和技术参数,能够在较大规模条件下分离纯化碱性磷酸酶,同时在此基础上提取和精制肝素钠。本研究与文献报道的几个显著区别有①文献者大多采用硫酸铵法分级沉淀碱性磷酸酶,而本发明采用***沉淀法;②文献中以***化钠的Tris-HCl缓冲液作为酶提取液,本发明则以含有一定浓度***化镁、***化钠和***化锌的Tris-HCl缓冲液提取酶,其优点是可以更有效保护酶的活性。
③本发明采用DEAESepharose4B离子交换色谱柱和SephadexG-150凝胶过滤色谱柱组合分离纯化碱性磷酸酶,所有色谱柱和洗脱剂均适合于大量生产该酶制剂。
④本发明采用先低温减压浓缩后真空冷冻干燥的方法制备酶制剂,这种方法的优点是既可保证酶的活性不受损失,又能提高生产效率,从而达到多快好省的提取效果。
(3)目前肝素钠生产大多采用盐解工艺。本发明则以提取碱性磷酸酶后的滤渣为原料,经盐溶后采用酶解工艺并对酶解参数进行了优化,水解效果更好,肝素的得率更高。在洗脱过程中本发明采用分部洗脱技术,可将与离子交换树脂有不同结合力的成分逐步洗掉,从而得到精制肝素钠。
附图为本发明的工艺流程图。
具体实施例方式本发明以下结合各目标物的具体制备方法及过程做进一步描述,但并不限制本发明的保护范围。
1、碱性磷酸酶的分离和纯化(1)将猪小肠清洗干净,取其粘膜经剪碎后,按固液比1∶3加入4-10℃-HCl缓冲液(,***化镁-***化钠-***化锌),在打浆机中充分匀浆,尔后将浆液于4-10℃低温中放置10h以上。
(2)往匀浆液中加入预冷的正丁醇使正丁醇的浓度达到20%-25%(V/V),经充分搅拌后,再于不高于37℃水浴中保温搅拌20-30min,然后在室温下放置8-10h。
(3)用板框压滤机压滤或离心机离心(3000-5000r/m)后,收集滤液,沉淀用于提取肝素。
(4)在搅拌条件下于滤液中加入等体积冷***,混匀后于转速
3000-6000r/min下离心10-20min,弃去上清液。
(5)向沉淀中加入约3-5倍量(W/V)-HCl缓冲液(,***化镁-***化钠-***化锌),充分搅拌使其溶解即为所得碱性磷酸酶粗酶液。
(6)-HCl缓冲液(,***化镁-***化钠-***化锌)平衡过的DEAESepharose4B柱(×100cm)中,每次加样量为30ml,()洗脱,其中含NaCl浓度由0至1mol/L的直线梯度洗脱,,部分收集,每管收集4mL,用280nm检测洗脱峰,用磷酸苯二钠为底物检测洗脱峰的酶活力,并将有活力的洗脱峰合并。
(7)将合并的活性洗脱液用旋转薄膜蒸发器于35℃以下真空浓缩,使其中蛋白质的浓度达到约1%。
(8)将酶蛋白浓缩液加进SephadexG-150凝胶过滤柱层析(×100cm),采用恒压装置,(,),,部分收集,每管体积约4mL。用280nm检测洗脱峰,用磷酸苯二钠为底物检测洗脱峰的酶活力,并将有活力的洗脱峰合并。
(9)将合并的活性洗脱液用旋转薄膜蒸发器于35℃以下真空浓缩,当其中蛋白质的浓度达到约