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专利名称:以多元共聚物为骨架的多孔型微珠状固定化酶载体及制法的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种固定化酶生物技术,特别是涉及一种以多元共聚物为骨架、经表面改性的多孔型微珠状固定化酶载体及其制备方法。
六十年代初,Katchallski-Katzir等人首先将一些蛋白水解酶固定于不溶性的载体上或包裹在人工膜中,制成固定化酶,,773-908,1966。1967年日本TanakeSeiyaku公司Chibata等人首次成功地将固定化酶技术用于工业生产,,603-615,1967中描述的。他们使用固定化氨基酸酰化酶将人工合成的外消旋DL-氨基酸转化为相应的L-型对映体。1970年前后,另外两个固定化酶系统相继投入中试生产。一个是英国用固定化青霉素酰化酶水解青霉素G或V生产6-氨基青霉烷酸,,321-334,1971所述;另一个是美国用固定化葡萄糖异构酶转化葡萄糖生产果糖,如文献4AppliedBiochemistryandBioengineering,,pp222-,1976所述。这些成功的工业应用促进了固定化酶技术的广泛深入研究,使以固定化酶为催化剂的工业过程的数量稳定增加。
利用固定化酶进行工业生产,不仅使酶可以回收,重复使用,降低了催化剂成本,还提高了酶的稳定性,避免了酶蛋白对产物造成的污染,简化了后处理。其研究和应用迅速发展,在工业生产和生化分析中获得广泛应用,成为现代生物技术中最活跃的领域之一。
酶固定化方法可归纳为载体结合法、交联法和包埋法三大类。载体结合法是将酶结合于水不溶性载体上的一类固定化方法。根据结合的形式不同,又可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等。物理吸附法是指酶被物理吸附于不溶性载体上。载体有活性碳、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、淀粉、合成树脂等。此法具有酶活性中心不易被破坏、酶结构变化小的优点,但酶与载体相互作用力弱,酶易脱落。离子结合法将酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂,例如DEAE-纤维素、CM-纤维素等。此法操作简单,条件温和,酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏,能得到酶活收率较高的固定化酶。但是载体与酶的结合力较弱,容易受缓冲液种类或pH的影响;在离子强度高的条件下反应时,酶易从载体上脱落。共价结合法是将酶以共价键结合于载体上。此法或是将载体有关的基团活化,然后与酶有关的基团发生偶联反应,或是在载体上接一个双功能试剂,然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有氨基、羧基、羟基、酚基等。共价结合法反应条件比较苛刻,操作复杂,并且易引起酶的高级结构变化,破坏部分活性中心,酶活收率一般为
30%左右,但是酶结合牢固,稳定性好。它是载体结合法中应用最多的一种。工业上广泛采用共价结合法制备固定化酶。
载体结合法所用的载体有膜状、纤维状和颗粒状,所用的基质材料有天然聚合物和合成聚合物两类。天然聚合物有琼脂糖、明胶,如文献5抗生素,13(3),177-180,1988所述;又如文献6中国医药上业杂志,24(3),100-103,1993和文献7中国抗生素杂志,15(5),338-341,1990中所介绍的几丁质以及文献8丝绸,(8),13-15,19,1996中介绍的丝素膜等。合成聚合物有文献9DE3515252介绍的苯乙烯——二乙烯基苯颗粒、文献10山西大学学报,自然科学版,14(3),273-277,1991介绍的大孔吸附树脂、文献11(JP5959191,JP58190399)介绍的离子交换树脂、文献12微生物学报,38(3),204-207,1998介绍的聚丙烯***纤维等。膜状和纤维状载体用于反应器时,液相混合不好,不利于反应过程中酸度的调控,而且需要人工将载体装填入反应器,劳动强度大,反应过程不稳定。另一方面,膜状和纤维状载体所用材质往往不是专用于固定化酶的,影响酶活性的发挥,如聚丙烯***纤维原用于纺织,离子交换树脂原用于水
处理和其它分离过程,几丁质则是经过化学处理的天然聚合物,批次质量难以稳定。
本发明的目的为了克服上述固定化酶载体的缺点,解决载体与酶结合弱的问题,减少酶从载体上脱落的几率;为了提高固定化酶的活性;为了克服已有载体批次不同质量难以相同的缺点;为了促进我国固定化酶技术的产业化和相关产业的发展,提供了一种性能优良的以多元共聚物为骨架、经表面改性的多孔型微珠状固定化酶载体。
本发明的目的是这样实现的本发明提供的以多元共聚物为骨架的多孔型微珠状固定化酶载体的制备方法依下列步骤进行(1)微珠制备共聚单体有四类(A、B、C、D),其配料比例如下单体A5-30重量份;单体B5-30重量份;单体C40-90重量份;单体D0-10重量份;其中单体A包括苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯和α-***苯乙烯中的一种或多种,单体B包括二乙烯基苯和异***尿酸三烯丙酯中的一种或两种,单体C包括乙酸乙烯酯,单体D包括***丙烯酸甲酯、***丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和***丙烯酸中的一种或多种;将A、B、C、D四类单体按上述比例充分混合。按照每100g上述混合好的单体计,-,致孔剂6-30ml和200#汽油0-20ml。其中引发剂采用本行业通用的引发剂,如偶氮二异丁***(AIBN)或过氧化苯甲酰
(BPO),致孔剂采用本行业通用的制孔剂,如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯或丁酸丁酯;在单体总体积3-4倍的含有1-4wt%的明胶及1wt%Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温,升温速率为045-℃/min,65-70℃聚合5小时,70℃以上固化6-10小时,过筛,用大量的水洗涤,然后用***浸泡,洗去致孔剂,得到多孔型微珠。
(2)表面改性将上述微珠风干,加入过量的含3-5wt%NaOH的甲醇溶液,18-25℃反应24-48小时后,抽滤,用***洗涤二次,即制得固定化酶用的载体。
该载体的内外表面带有大量羟基(-OH),易于活化,而且硬度高,从而提高了固定化酶的活性。通过调节各单体的配比和改性条件来控制可活化羟基的数量和密度。
本发明提供的以多元共聚物为骨架的多孔型微珠状固定化酶载体,其颗粒直径为80-400μm,-,-(干重)。它可由下述四类单体按下述配料比例经悬浮共聚而制得;单体A5-30重量份;单体B5-30重量份;单体C40-90重量份;单体D0-10重量份。
本发明的效果本发明制备的固定化酶载体颗粒直径为80-400μm,-,适合于反应器操作;不易染菌,强度优于国外通常采用的琼脂糖6B;活性基团多,可活化羟基数量达到
-,高于德国载体EupergitC2-3倍;成本低,制备方法简单。将本发明的载体活化后结合青霉素酰化酶,制成的固定化青霉素酰化酶比用琼脂糖6B微珠制备的固定化酶活性高5-10倍,比用EupergitC制备的固定化酶活性高2-3倍,酶活收率平均为37%;将本发明的载体活化后结合糖化酶或葡萄糖异构酶,制成的固定化酶的综合性能优于使用其它载体。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
2将上述微珠风干,加入过量的含3wt%NaOH的甲醇溶液,18℃反应24小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含5wt%NaOH的甲醇溶液,22℃反应36小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。实施例51将苯乙烯20g、二乙烯基苯15g、乙酸乙烯酯60g、***丙烯酸5g充分混合,加入引发剂偶氮二异丁***(AIBN),致孔剂丁酸乙酯15ml和200#汽油15ml,%明胶及1wt%Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温,℃/min,67℃聚合5小时,72℃固化2小时,75℃,80℃继续固化1小时后,停止反应,过筛,用大量的水洗涤,然后用***浸泡,洗去致孔剂。
2将上述微珠风干,加入过量的含4wt%NaOH的甲醇溶液,
25℃反应24小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含3wt%NaOH的甲醇溶液,18℃反应48小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含5wt%NaOH的甲醇溶液,22℃反应36小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含4wt%NaOH的甲醇溶液,25℃反应24小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含3wt%NaOH的甲醇溶液,18℃反应48小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含5wt%NaOH的甲醇溶液,22℃反应36小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
2将上述微珠风干,加入过量的含4wt%NaOH的甲醇溶液,25℃反应24小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得固定化酶用的载体。
权利要求
,其特征在于依下列步骤进行
(1)微珠制备将单体A5-30重量份、单体B5-30重量份、单体C40-90重量份、单体D0-10重量份充分混合;每100g上述混合好的单体,-,致孔剂6-30ml和200#汽油0-20ml;在单体总体积3-4倍的含有1-4wt%的明胶及1wt%Mg(OH)2的悬浮体系中进行聚合反应。40℃开始缓慢升温,-℃/min,65-70℃聚合5小时,70℃以上固化6-10小时,用通常的方法过筛及用大量的水洗涤,然后用***浸泡,洗去致孔剂,得到多孔型微珠;(2)表面改性将上述得到多孔型微珠风干,加入过量的含3-5wt%NaOH的甲醇溶液,18-25℃反应24-48小时后,抽滤,用***洗涤三次,即制得产品。
,其特征在于所述的单体A包括苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯和α-***苯乙烯中的一种或多种;所述的单体B包括二乙烯基苯和异***尿酸三烯丙酯中的一种或两种;单体C包括乙酸乙烯酯;所述的单体D包括***丙烯酸甲酯、***丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸和***丙烯酸中的一种或多种。
,其颗粒直径为80-400μm,-,-(干重);它可由下述单体按照下述配料比例经上述悬浮聚合方法而得单体
A5-30重量份;单体B5-30重量份;单体C40-90重量份;单体D0-10重量份。
全文摘要
本发明涉及以多元共聚物为骨架的多孔型微珠状固定化酶载体及其制法。制法用四类共聚单体,将单体A5—30重量份、单体B5—30重量份、单体C40—90重量份和单体D0—10重量份充分混合,在单体总体积3—4倍的含有1—4wt%的明胶及1wt%Mg(OH)