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仙人掌内生真菌的制作方法.docx

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仙人掌内生真菌的制作方法.docx

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专利名称:仙人掌内生真菌的制作方法
技术领域:
本发明涉及微生物技术领域,特别是涉及一种其发酵物具有药用功能的微生物。
背景技术:
仙人掌(Opuntia)在中国作为药用植物具有悠久的历史,仙人掌含有有机酸、甾醇、生物碱、黄***和萜类等成分,具有抑菌、消炎、镇痛、降血糖等多种药理作用及多种临床用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离自中国云南省元江县元江仙人掌(OpuntiaficusindicaMill.)植物活体中且其发酵产物具有较强的抑菌活性的微生物----仙人掌内生真菌。
本发明所述的仙人掌内生真菌命名为土生曲霉云南变种YM39661(),现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位,保藏编号为CCTCCNOM205132。
本发明所述的仙人掌内生真菌系从中国云南省元江县元江仙人掌(OpuntiaficusindicaMill.)植物活体中分离获得的。现保藏在国家知识产权局专利局保藏单位保藏,保藏单位名称中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2005年10月31日,保藏编号为M205132。
本发明所述的微生物菌种经形态观察、培养特征以及分子生物学18SrDNA基因序列分析,确认其分类学地位属于土生曲霉的一个新变种,命名为土生曲霉云南变种YM39661()。
土生曲霉云南变种YM39661形态特征与土生曲霉较为相似,但其显微形态表明分生孢子梗壁上有很明显的瘤状突起,这与土生曲霉的模式菌株及其它记载的变种土生曲霉原变种()和土生曲霉金色变种()都存在明显区别。因此,该菌株为土生曲霉的一新变种。
以18SrDNA基因序列同源性为基础构建形成包括菌株YM39661在内的相关真菌的系统发育树。结果看出,YM39661与土生曲霉(Aspergillusterreus)%,有3个碱基的差异。
YM39661的培养基培养特征(图1、2、3)在查氏琼脂平板上,28℃培养7d后,,质地致密,菌落平坦,中央部分有白色凸起,分生孢子结构较多,初为浅黄色,老后变深呈黄褐色,菌落反面暗黄色,较淡。
在PDA琼脂平板上,28℃培养7d后,,,质地较薄,中央有凸起,开始有少量同心环,中央为淡黄色,四周近白色,老后菌落呈土褐色,气生菌丝较少,背面淡黄色至黄褐色。
在麦芽汁培养基上28℃,,质地致密略呈絮状,菌落较薄,中央部分稍凸起,气生菌丝少,反面近无色。
YM39661内生真菌的形态特征(图4、5、6)①无性世代菌丝无色有隔膜。分生孢子梗较长,具有足细胞;分生孢子梗顶端膨大成近球形,顶囊较小,半球形,直径6-15μm。产孢结构双层,分生孢子梗基5-7μm×2-3μm,-×-;分生孢子头致密,直柱状,颜色土黄略显橙褐色,直径30-110μm×25-50μm;分生孢子球形,大小约2μm,壁光滑。
另外,在光学镜下分生孢子梗壁平滑,扫描电镜下有明显较密的瘤状突起,透射电镜显示分生孢子梗外壁粗糙。
②有性世代未发现。
YM39661内生真菌的分子生物学特征采用分子生物学PCR技术,DNA测序分析,YM39661内生真菌18SrDNA基因组由1800个碱基组成。该系列由国际NCBI的GenBank数据库注册(Accessionnumber是DQ173743)。内生真菌YM39661的DNA序列与GenBank中相关序列比对了1078个碱基,同源性为高于99%。以18SrDNA序列为基础构建的系统发育树,菌株YM39661与土生曲霉Aspergillusterreus的进化距离最近(图7)。
YM39661内生真菌发酵培养特征培养基液体PDA培养基。
培养温度30℃±2℃。
发酵时间5-7天。
发酵培养特征培养第1天,菌体为少量黄色的细粉末;培养第3天,黄色的细粉末减少,出现黄色的小菌丝球;培养第5天,黄色的细粉末逐渐减少,黄色菌丝球继续增多,并且体积变大,发酵液为橙黄色;培养第7天,出现大量黄色的菌丝球,体积也变大,发酵液为橙黄色。
YM39661内生真菌的发酵工艺如下菌种→活化→一级种子(固体PDA)→培养(28℃±2℃,3-4天)→接种(接种针一环)→二级种子(液体PDA)→培养(摇床rpm200转/分,28℃±5℃,4-5天)→接种(接种量5%)→发酵(500毫升玻璃瓶,28℃±5℃,12-15天)→发酵物。
上述发酵工艺中,编号YM39661菌种的发酵条件如下(1)发酵方式液体发酵。
(2)种子培养种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)。
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)制备取新鲜马铃薯200克,去皮切成小块,加水1升煮沸30分钟,过滤弃马铃薯,滤夜加水补足至1升,加入葡萄糖20克,PH自然(即不对其进行限制,以下相同)。
上述马铃薯葡萄糖培养基中加入琼脂15克,即为固体PDA
培养基。
(3)发酵培养发酵培养基为液体PDA培养基,PH自然。
(4)培养时间菌种活化培养48-72小时,种子摇床培养时间72-96小时,发酵培养时间5-7天。
(5)培养温度种子培养温度28℃±2℃,发酵培养温度为30℃±2℃。
(6)发酵完毕,发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体,取发酵液加入等体积95%(重量百分比)乙醇,浸提48小时后浓缩至干,加入无菌水制成发酵液样品,即为抗菌发酵液。
本发明首次对仙人掌植物内生真菌进行分离,并明确了具有广谱抗菌活性的土生曲霉云南变种(YM39661)菌株的微生物学地位,同时发现该菌对16种细菌、3种植物病原真菌以及2种人类皮肤致病真菌具有较为明显的抑制生长作用。目的是利用植物内生真菌资源,以求获得抗人类疾病新型抗生素类天然药用成分。
本发明所述的仙人掌内生真菌YM39661抗菌试验1、病原细菌革兰氏阳性细菌11种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis);白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus);蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus);结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis);肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae);甲型溶血链球菌(Streptococcushemolyticus);乙型溶血链球菌
(Streptococcushemolyticus);耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis);表皮葡萄球菌(Staphylococcusaureus);藤黄八叠球菌(Sardinelutea)。
革兰氏阴性细菌5种大肠杆菌(Escherichiacoli);普通变形杆菌(Pratevulgaris);铜绿色假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa);伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi);宋内氏痢疾杆菌(Shigellasonnei)。
2、病原真菌皮肤致病真菌2种白色念珠菌(Candidaalbicans);石膏样小孢子菌(Microphytongypseum)。
植物病原真菌3种灰葡萄孢(Botrytiscinerea);棒束孢(Isariasp.)和玉蜀黍离蠕孢(Bipolarismaydis)。
3、内生真菌的培养将仙人掌内生真菌Ym39661接入25mL三角瓶中(装有7mLPDA液体培养基),置于(28±2)℃摇床上(200r/min)旋转培养5d,无菌条件下过滤除去菌丝体,取发酵液加入7mL95%的乙醇,浸提48小时后浓缩至干,加入少量无菌水制成发酵液样品备用。
4、病原微生物的培养取病原菌的新鲜斜面培养物分别接入少许无菌水,用接种环搅拌稀释后制成菌悬液。
5、,倒入约40-50℃的牛肉膏琼脂培养基于培养皿中,混匀,培养基凝固后表面放入牛津杯,每个牛津杯中加入200μL内生真菌发酵液样品,置于37℃培养24h,测量抑菌圈直径的大小
(详见附表)。
,用无菌涂布棒涂匀,放入牛津杯,每个牛津杯中加入200μL内生真菌发酵液样品,置于28℃培养48h,测量抑菌圈直径的大小(详见附表)。
附表本发明所述的菌株YM39661对21种病原微生物的抗菌结果
图1为本发明所述的土生曲霉云南变种YM39661的菌落图片(PDA培养基)。
图2为本发明所述的土生曲霉云南变种YM39661的菌落图片(麦芽汁培养基)。
图3为本发明所述的土生曲霉云南变种YM39661的菌落图片(查氏培养基)。
图4为本发明所述的土生曲霉云南变种YM39661显微图。
图5为本发明所述的土生曲霉云南变种YM39661扫描电镜图。
图6为本发明所述的土生曲霉云南变种YM39661投射电镜图。
图7为本发明所述的土生曲霉云南变种同源性的系统发育树图。
具体实施例方式
土生曲霉云南变种YM39661()
菌株,是发酵获得抗人类疾病新型抗生素类药用成分的天然微生物药源。
取YM39661菌种,在无菌条件下(无菌室或超净工作台),用接种针挑取少许菌种,转接于已灭菌的固体PDA培养基试管(15×150mm)中,置培养箱内28℃±1℃活化培养72-96小时,备用。取出活化后的菌种,在无菌条件下,以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的一级种子液体PDA培养基中,在28℃±2℃下培养72-96小时,即为YM34161一级种子。
采用500毫升玻璃三角瓶,装入配制好的液体PDA培养基100毫升,15磅灭菌30分钟备用。取YM39661菌株一级种子,在无菌条件下,接种于装有100毫升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中(接种量按7-10%(v/v)计)。置30℃±2℃摇床(200r/min)培养96-120小时,期间注意检查有无染菌现象。
发酵完毕,无菌条件下过滤发酵液,除去菌丝体,取发酵液加入等体积95%乙醇,浸提48小时后浓缩至干,加入无菌水即制成抗菌发酵液样品。
本发明所述的土生曲霉云南变种YM3966118SrDNA基因组由1800个碱基(bp)组成,系列如下1gaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacgg61ggaggtagtgacaataaatactgatacggggctctttcgggtctcgtaattggaatgagt121acaatctaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcgg181taattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaac241cttgggtctggctggccggtccgcctcaccgcgagtactggtccggct
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权利要求
,其特征是命名为土生曲霉云南变种