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专利名称:从高细胞密度培养物纯化腺病毒的方法
技术领域:
本发明涉及病毒制备领域。更具体地,本发明涉及从细胞悬液纯化腺病毒颗粒的改进方法。
背景技术:
疫苗制备领域近来的进展产生了对大规模生产的需求。亟需稳健和高效的方法来为全世界提供足量的(重组)疫苗以对抗传染病。针对传染病的疫苗可以基于重组腺病毒颗粒。为此进行了大量的努力以优化基于细胞的腺病毒制备方法。将细胞以渐增密度培养,随后感染以获得更高的总病毒收率。这样的高细胞密度方法公开于例如CrucellHollandBV的WO2010/)。其中描述了制备高浓度重组腺病毒的方法。这种优化方法依赖于这样的能力,即以高细胞密度(例如,高于切106细胞/ml)感染培养物并保留高的每细胞病毒产率。这提供一种在单生物反应器中获得高病毒浓度的收获病毒溶液的方法。所述方法通常的病毒颗粒(VP)-。以高密度培养细胞的方法易于积累大量的细胞碎片和宿主细胞DNA。在纯化过程中必须进一步除去这些污染物,而这是繁琐的操作。US7326555最近公开一种从收获的细胞培养物除去宿主细胞DNA的方法。所述方法由选择性地从细胞培养物沉淀宿主细胞
DNA组成。选择性沉淀剂可以特异性地结合宿主细胞DNA,并且不沉淀腺病毒颗粒。然而,该文献中的方法仅对低细胞密度细胞培养物进行描述,其中细胞碎片和宿主细胞DNA存在的量不尚ο目前尚未知所述方法可以应用于包含高细胞密度的培养物。相比之下,从现有技术可以推知的强烈建议是,当以高浓度使用时用于所述方法的沉淀剂不会选择性地从培养物沉淀宿主细胞DNA,并且会沉淀病毒颗粒()。通常将包含腺病毒的细胞培养收获物进一步加工以获得纯化的腺病毒。所述纯化方法中通常包括利用例如深层过滤和/或切向流过滤(TFF)的澄清步骤。TFF的使用要求相对纯(clean)的收获物,即包含有限量的细胞碎片或其他杂质,例如宿主细胞DNA。过量的所述杂质可能阻塞过滤器。因此,通过TFF进行的澄清通常用于进一步的纯化方法,例如作为第三或第四方法步骤。收获后利用切向流过滤直接从包含腺病毒的细胞悬液分离腺病毒此前在例如EP1371723中有描述。然而,腺病毒生长于粘附的细胞,其在收获后保留在生物反应器中。因此,进一步加工的含病毒悬液包含非常低浓度的细胞碎片和宿主细胞DNA。W02006/052302还描述了在收获后直接使用TFF。然而,其中所用的含病毒收获物的细胞密度大大低于切106细胞/ml。如本文所公开的,收获后在澄清步骤中直接使用TFF对于包含高细胞密度的细胞培养物是不可行的。由于细胞培养方法是放大级别上升的,并且细胞以渐增的密度进行培养,所以工业中亟需允许处理高细胞密度悬液的下游方法。这特别适用于腺病毒制备领域。
发明_既述本发明涉及从细胞悬液中,特别是从高细胞密度悬液中纯化来自细胞裂解物的腺病毒颗粒的方法。如本文所示(实施例1),用现有的方法从高细胞密度悬液纯化腺病毒的病毒回收率很低。收获后获得的高细胞密度悬液中的杂质浓度通常过高而无法实现直接的腺病毒纯化。利用已知方法进行高细胞密度悬液的下游加工通常要求多个步骤。第一过滤步骤由粗滤组成以除去大沉淀和细胞碎片。随后,需要一个或多个选择性过滤步骤以获得足够纯化的腺病毒悬液。我们令人惊讶地发现并在本文公开了,紧随制备包含腺病毒的细胞裂解物之后,连续使用宿主细胞DNA破碎和/或沉淀,接着进行包括切向流过滤(TFF)的澄清步骤,得到了高度纯化的腺病毒悬液。令人惊讶的是,包含腺病毒、大量细胞碎片、宿主细胞DNA和其他杂质的细胞裂解物可以由本发明有效地加工成纯化的腺病毒。因此,本发明提供一种适合于在大规模腺病毒纯化过程中除去宿主细胞DNA的新方法。通过将DNA破碎或沉淀并入纯化过程,使用TFF进行澄清的,单一的澄清步骤就足以从高细胞密度悬液中纯化腺病毒。本发明提供一种从具有范围为5x106-150X106细胞/ml的细胞密度的细胞悬液中纯化腺病毒颗粒的方法,所述方法包括a)将所述细胞悬液中的细胞裂解;
b)将所述细胞悬液中的宿主细胞DNA破碎和/或沉淀;以及c)通过切向流过滤对得自步骤b)的细胞悬液
进行澄清。在一些实施方案中,所述腺病毒纯化自细胞悬液,其具有的细胞密度范围为5xl06-150xl06细胞/ml,例如5xl06_50xl06细胞/ml或10xl06_30xl06细胞/ml。在另一实施方案中,所述步骤b)中的沉淀是通过加入选择性沉淀剂来将宿主细胞DNA从腺病毒颗粒沉淀而进行的。在优选实施方案中,-。在其他优选实施方案中,用中空纤维进行所述切向流过滤。在优选的实施方案中,用ATF系统进行所述切向流过滤。
图1低(-)和高(20xl06-30xl06vc/ml密度细胞悬液中,针对度米芬浓度作图的腺病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。图2低(-)和高(18xl06_25xl06vc/ml)密度细胞悬液中,针对度米芬浓度作图的腺病毒回收率和沉淀的宿主细胞DNA。发明详述本发明涉及用于从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒的方法。根据本发明,所述高细胞密度悬液通过将细胞培养至高细胞密度而获得。这样的培养可以,例如批量、加料批量或灌注模式来进行。将细胞培养至高细胞密度的方法为本领域技术人员已知。获得高细胞密度培养物的具体方法公开于,例如
W02004/099396、W02005/095578、W02008/006494、W02010/060719。
根据本发明,高细胞密度悬液包含约5χ106-150Χ106细胞/mL,例如约8x106-120x106细胞/mL,如约12xl06-100xl06细胞/mL,如约20xl06-80xl06细胞/mL。在本发明的优选实施方案中,所述高细胞密度悬液的细胞密度范围为约10x106-50X106细胞/mL,例如至少约15xl06细胞/mL,如至少约20xl06细胞/mL,如至少约25xl06,如高达约30xl06细胞/mL,如高达约35xl06细胞/mL,如高达约40xl06细胞/mL,如高达约45x106细胞/mL。根据本发明,用腺病毒颗粒感染高细胞密度培养物以允许所述腺病毒在细胞悬液增殖。在本文中,在单一生物反应器中获得高细胞密度悬液,其包含高浓度的腺病毒。感染高细胞密度培养物的方法也是本领域技术人员已知的。、。这些参考文献描述了用于制备大量重组腺病毒的方法。这些方法依赖于用每细胞高腺病毒产率的保存物感染高细胞密度的培养物的能力。本文则提供了一种在单一生物反应器中获得高腺病毒浓度的高细胞密度悬液的方法。本发明方法的典型收率,例如对于重组腺病毒35(rAd35)。根据本发明,一旦腺病毒在细胞培养物中增殖并杀死大部分细胞,则从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒。本
发明方法的第一步骤包括将高细胞密度悬液中所包含的细胞裂解。裂解用腺病毒颗粒感染的高细胞密度悬液导致大量细胞碎片和宿主细胞DNA积累在所述细胞悬液中。这些积累使得细胞悬液随后的下游加工冗长繁琐。本发明提供一种适合于从高细胞密度悬液的细胞裂解物纯化腺病毒颗粒的方法。通过向细胞裂解物加入选择性沉淀剂可以从高细胞密度悬液中的腺病毒颗粒选择性沉淀大量宿主细胞DNA,从而从包含腺病毒颗粒的高细胞密度悬液沉淀至少约80%的宿主细胞DNA分子。如本文所公开的,在用TFF澄清后,沉淀步骤允许沉淀污染宿主细胞DNA,至少减少80%的宿主细胞DNA,优选90%,并且如本文所示例的,甚至更优选减少约95%的宿主细胞DNA。藤所述方法的第一步骤包括将细胞悬液中的细胞裂解。其中裂解细胞膜的第一步骤允许从感染的高细胞密度悬液收获细胞相关(细胞内)和非细胞相关(细胞外)腺病毒。裂解包含病毒的宿主细胞的优选方法宿主细胞洗涤剂裂解可以由非机械裂解方法(如酶处理)和和/或机械剪切方法(如中空纤维超滤)代替以释放最大量的腺病毒。可以用于激活细胞裂解的方法为本领域技术人员已知,并且例如讨论于WO98/22588,--解冻、固体剪切、高渗和/或低渗裂解、液体剪切、超声、高压挤出、洗涤剂裂解、上述方法的组合等。在本发明的一实施方案中,利用至少一种洗涤剂将细胞裂解。使用洗涤剂裂解的优势在于其是一种容易的方法,并且容易放大。可以使用的洗涤剂及其使用方法通常为本领域技术人员已知。例如几种实例讨论于
TO98/22588,-、阳离子、***离子和非离子洗涤剂。洗涤剂的实例例如Triton和/或聚山梨酯-80。在一实施方案中,所用的洗涤剂为TritonX-IOO0此外,可以向裂解物或澄清的裂解物加入低浓度的诸如TNBP的溶剂以补充这些洗涤剂失活包装的病毒的能力。另外,感染的宿主细胞由其中的腺病毒的自裂解可以提供细胞内腺病毒的主要释放,并且可以用于本发明的方法。因此,本领域已知的任何形式的宿主细胞裂解可以用于向宿主细胞培养基中释放细胞内病毒以用于通过本文公开的方法进行最后收获。本领域技术人员应当了解,洗涤剂的最优浓度可以变化,例如在0.-1%(w/w)的范围内变化。破碎和诜择件沉淀裂解后,可以将宿主细胞DNA破碎并从包含病毒的细胞悬液沉淀。在一优选实施方案中,通过加入选择性沉淀剂(SPA)溶液来沉淀宿主细胞DNA。这一步骤允许选择性沉淀宿主细胞DNA,同时将未改性的病毒颗粒留在液相中。如本文所示例的,这一早期沉淀步骤在澄清后导致至少约90%的宿主细胞DNA减少。可以用于实施本发明的SPA包括但不限于***共聚物、季铵化合物及其任何各自的混合物。更具体地,许多形式的聚乙烯(PEI)非常有效地中和过量的阴离子电荷
(DNA杂质)。可以合适地用于本发明的一系列可能的SPA列于(12栏,56-67行和13栏,1-28行),其援引加入本文。适合用于本发明的SPA包括但不限于以下可商购产品的类型和实例单烷基三***铵盐(可商购产品的实例包括十六烷基三***溴化铵或十六烷基三******化铵,CTAB;四癸基三***溴化铵或四癸基三******化铵(TTA);烷基三******化铵;烷基芳基三******化铵;十二烷基三***溴化铵或十二烷基三******化铵;十二烷基二***-2-苯氧基乙基溴化铵;十六烷基***盐酸盐或氢溴酸盐;十二烷基***或盐酸盐;以及十六烷基二***乙基溴化铵或十六烷基二***乙基***化铵);单烷基二***苄基铵盐(实例包括烷基二***苄基***化铵和苄索***铵,BTC);二烷基二***铵盐(商业产品包括度米芬(DB);二癸基二***卤化铵和和辛基十二烷基二******化铵或辛基十二烷基二***溴化铵);杂芳香铵盐(商业产品包括十六烷基卤化吡啶鐺(CPC或氢溴酸盐和十六烷基溴化吡啶鐺或十六烷基***化吡啶鐺);顺式异构体1-[3_***烯丙基]_3,5,7-三氮杂-1-氮鐺金刚烷;烷基-溴化异喹啉鐺;以及烷基二***萘基-******化铵(BTC1110)。多取代的季铵盐(可商购的产品包括但不限于烷基二***苄基糖精铵和烷基二***乙基苄基环己基氨基磺酸铵);双季铵盐(产品实例包括1,10-双O-***-4-氨基***化喹啉鐺)_癸烷;1,6_双{1-***-3-(2,2,6-三***环己基)-
丙基二******化铵]己烷或曲比***铵以及BuckmanBrochures的称为CDQ的bis-quat);禾口聚合季按盐(包括polyionene,如聚[氧化乙烯(二***亚氨基)亚乙基(二***亚氨基)亚乙基二***化物];聚[N-3-二***铵基)丙基]N-[3_亚乙基氧化乙烯二***铵基)丙基]脲二***化物;和α-4_[1-三O-羟基乙基)***化铵)。本领域技术人员从US73^555应当理解,其中这些化合物中的几种据证实发挥作用,并且其中据证实本领域技术人员可以常规地发现这些化学选择性沉淀DNA的合适浓度,这些为SPA的实例,并且基于其公开和本发明的公开,这些化合物显然也适合于本发明。在一优选实施方案中,阳离子洗涤剂用于本发明。在甚至更优选的实施方案中,二烷基二***铵盐如度米芬(DB)用于本发明。尽管大量潜在的SPA可以用于实施本发明,但是度米芬主要由于其作为GMP等级原料的可用性以及目前用在目的是人用途的其他产品而引起特别关注。更特别地,由于度米芬广泛用作口服卫生产品以及局部抗生素乳膏的活性成分,所以这种分子在cGMP条件下大量生产并分配。本文测定在高细胞密度悬液中用于从细胞悬液沉淀宿主细胞DNA的最优SPA浓度。尽管基于现有技术预期,当腺病毒颗粒与高浓度SPA接触时会立即沉淀,但是意料之外的是腺病毒颗粒仍保持未沉淀。确实,例如在US73^555中,据现有技术证实,在低细胞密度悬液(高达IxlO6细胞/ml)中,腺病毒颗粒当阳离子洗涤剂浓度增加时发生沉淀。如本文所公开的,通过裂解高细胞密度培养物而制备的悬液会包含大量增加量的宿主细胞
DNA和其他杂质,并因此需要增加量的阳离子洗涤剂(例如,增加2倍)。因此基于低细胞密度结果的外推,预期阳离子洗涤剂浓度的这种增加会导致悬液中存在的腺病毒颗粒的整体的沉淀。然而,令人惊讶地,在高SPA浓度下,从包含病毒颗粒的高细胞密度悬液选择性除去污染宿主细胞DNA仍然是可以的。在本发明的一优选实施方案中,加入的SPA(优选DB)-5mM。在一甚至更优选的实施方案中,加入的SPA(优选DB)-,,-,-。基于本发明的公开,本领域技术人员应当清楚对于给定的收获时的细胞密度,如何确定合适的SPA浓度窗。用于处理包含腺病毒的高细胞密度悬液(包含的细胞密度为10χ106-150χ106细胞/mL)-5mM。用于处理包含腺病毒的高细胞密度悬液(包含的细胞密度为10χ106-50χ106细胞/mL)。用于处理包含腺病毒的高细胞密度悬液收获物(包含的细胞密度为10χ106-30χ106细胞/mL),-,-,-,-,-。如本文对度米芬(DB)所示例的,本领域技术人员应当了解如何测试本文公开的SPA的潜在代替物以鉴定有效地从腺病毒颗粒沉淀核酸分子和其他细胞碎片的化合物。因此,本发明部分地涉及从高细胞密度悬液纯化腺病毒颗粒的方法。所述方法包括通过向裂解后宿主细胞培养基中加入选择性沉淀剂来选择性地从裂解后的高细胞密度悬液沉淀宿主细胞核酸分子。尽管从细胞悬液除去宿主细胞