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专利名称:从融合多肽制备感兴趣的多肽的方法
技术领域:
本发明涉及从包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质分离感兴趣的蛋白质的方法,及可用于该方法的融合蛋白质。
背景技术:
随着基因重组技术的发展,难于天然获得的蛋白质可以通过利用基因工程化有机体大规模地生产,因而有助于人类的健康。、酵母、动物细胞等等。、高产出率和允许使用便宜的培养基的优点。
,蛋白质可以根据其特性表达为可溶解的形式或不溶的包含体。以可溶解的形式表达的蛋白质由于精确的蛋白质折叠而具有天然性质,在形成三级结构之前可以凝结在一起而不溶的蛋白质不显示其天然特性。因此,不溶蛋白质的包含体必须按照各种方法溶解,然后重新折叠。在后一种情况中,重折叠过程的回收率和产率较低。另外,在不溶解的蛋白质中的许多二硫键给精确的重折叠造成了困难,因此,有利的是产生可溶解形式的感兴趣的蛋白质。
当感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达时,大量地减少显著降低蛋白质的回收率
和产率的早期分离步骤如离心和使用膨胀床吸附(EBA)的过滤是可能的。为了以可溶解的形式表达感兴趣的蛋白质,可以将能够以可溶解的形式很好地表达的融合伴体与感兴趣的蛋白质融合在一起。融合伴体的例子包括GST、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、泛素等。泛素是由76个氨基酸组成的小多肽。当感兴趣的蛋白质在与泛素的融合肽中表达时,泛素使得该蛋白质以可溶解的形式很好地表达,还提高了其表达率,因而使该蛋白质处于活性形式。
另一方面,当感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达时难于回收纯的蛋白质,而当感兴趣的蛋白质以不溶解的包含体的形式表达时,、DNA、多糖分离开。但是,分离可溶解的感兴趣的蛋白质是非常困难的,因为它与可溶解的污染物如宿主细胞的蛋白质、DNA、多糖混合在一起。包含体可以在破坏细胞以用EBA纯化包含体之前通过加入去垢剂如尿素得到溶解,。总之,当感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达时,或者要应用到EBA过程时,与DNA、多糖混合的感兴趣的蛋白质进入随后的纯化步骤。因此,仍然需要高效的纯化过程。
在典型的纯化过程中,可以利用电荷、溶解性、大小、疏水性等的不同从细胞内蛋白质中回收感兴趣的蛋白质。这些纯化过程采用了便宜的材料,但具有较低的选择性。因此,为达到理想的纯度,需要包括各种方法的许多步骤,而且通过这些纯化步骤纯化回收率大幅降低。另外,这些方法还存在着纯化步骤必须进行优化以满足各特定的感兴趣的蛋白质的特性的问题。为增加对感兴趣的蛋白质的选择性,通常可以使用亲合色谱法,其中识别该蛋白质的独特的结构的抗体被固定在树脂上,或者对特异的载体具有亲合力的尾可以被用作融合伴体。用于增加
选择性的例子包括GST、多聚组氨酸等(美国专利5108919号和韩国专利177304号)。在亲合色谱的情况下,对融合伴体或感兴趣的蛋白质具有亲合力的昂贵的树脂限制了其工业应用。
另外,当感兴趣的蛋白质以融合蛋白质的形式表达时,融合伴体必须在随后的步骤中通过切割除去,特别是,当感兴趣的蛋白质要应用于医药时,融合多肽必须被设计在感兴趣的蛋白质和融合伴体之间具有适宜的切割位点以在切割后产生精确的N-端或C-端,而且在感兴趣的蛋白质内部没有切割位点。切割反应可以用化学试剂如酸和CNBr,及蛋白酶如凝血酶原激酶和肠激酶进行。尽管酶具有相对高的选择性,它仍可能切割预期的切割位点之外的其它位点,此外,它还具有低效率和高成本。
在本发明之前,已经发展了包含与感兴趣的蛋白质具有不同的等电点的融合伴体的融合多肽,并用离子交换色谱进行了制备和分离。美国专利
4532207号提出,精氨酸尾与带负电的EGF融合,然后通过阳离子交换色谱纯化以生产EGF。但是,该方法具有一个缺点,就是直接连接在感兴趣的蛋白质C-端的一些离子型氨基酸的电荷被大的感兴趣的蛋白质的相反电荷掩盖,因此融合蛋白质不能有效地吸附在基质上。所以该方法的纯化回收率较低。
在美国专利5179196和5322930号中,融合多肽分别包含与感兴趣的蛋白质具有不同的电性质的融合伴体、感兴趣的蛋白质及SNBR切割位点和StaphV8切割位点。但是,这些专利还存在问题,许多具有相似的等电点的蛋白质以及融合蛋白质也可能被吸附到离子交换色谱上,而且切割方法选择性较差。因此,其它的被吸附到色谱上的蛋白质被切割并与感兴趣的蛋白质一起溶解。
发明内容
本发明提供了一种方便地以高回收率分离感兴趣的蛋白质的DNA构造。
本发明还提供一种包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质以方便地和高效地以高回收率分离感兴趣的蛋白质。
本发明还提供一种方便地和高效地以高回收率分离感兴趣的蛋白质的方法。
本发明提供了一种通过利用等电点的变化分离感兴趣的蛋白质的方法。
图1为泛素的三级结构示意图。
图2为当按照实施例3用阳离子交换色谱法分离融合蛋白质时,以各种盐浓度洗脱的融合蛋白质的SDS-PAGE分析片断的照片。
图3为按照实施例5用泛素切割酶处理后,加载到阳离子交换色谱并以400mM的盐浓度洗脱所获得的SDS-PAGE分析片断的照片。
图4为按照实施例6用泛素切割酶处理后,加载到阴离子交换色谱并以400mM的盐浓度洗脱所获得的SDS-PAGE分析片断的照片。
图5为按照实施例7用反相HPLC分析图3中的3道片断的色谱图。
图6为说明通过加载包括融合蛋白质的细胞溶解产物到阳离子交换树脂上,用低盐浓度的盐溶液洗涤及与吸附在阳离子交换树脂上的泛素切割酶反应可以制备高纯度的感兴趣的蛋白质的SDS-PAGE照片。
图7为通过EBA在阳离子交换树脂上吸附细胞抽提物、沉淀及与阳离子交换树脂柱中的泛素切割酶反应所获得的SDS-PAGE分析片断的照片。
图8为按照实施例11加载在薄膜上的样品、用NaCl溶液洗脱的溶液、脱盐后的UBP切割反应溶液和使UBP反应溶液通过薄膜获得的片断的SDS-PAGE分析的照片。
图9为按照实施例13加载在薄膜上的样品、用NaCl溶液洗脱的溶液、脱盐后的UBP切割反应溶液和使UBP反应溶液通过薄膜获得的片断的SDS-PAGE分析的照片。
具体实施例方式
本发明涉及从包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质分离感兴趣的蛋白质的方法、融合伴体及可用于该方法的融合蛋白质。
更具体地说,本发明提供了一种包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质,其中融合伴体包含可以被泛素切割酶在其C-端进行切割的氨基酸序列,而且其中感兴趣的蛋白质和融合伴体之间的等电点的差异至少为1。
除了特别指出的外,名词“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
名词“泛素切割酶”是指切割在蛋白质如真核细胞中的泛素的C-端与RGG相邻的肽键的酶。例如,该酶包括从酿酒酵母中获得的UBP1和UBP2、肌肉细胞中的UBP41等。由于泛素切割酶精确地切割相邻于泛素第76位氨基酸甘氨酸的肽键,在感兴趣的蛋白质中产生精确的N-端是可能的(美国专利5847097号)。
在本发明中,泛素可以被修饰以包括含6-10个选自His、Lys和Arg的组的氨基酸的尾。例如,修饰后的泛素可以是多聚组氨酸、多聚赖氨酸或多聚精氨酸等。
名词“感兴趣的蛋白质”是指要制备的蛋白质,包括生理活性蛋白质如生长激素、干扰素、白介素、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素和胰岛素。
这里,名词“融合伴体”是指包含可被泛素切割酶在其C-端进行切割的氨基酸序列,例如RGG,且与感兴趣的蛋白质的等电点相比具有1个或更多,,更优选为2个或更多的差异的肽。优选的融合伴体为使感兴趣的蛋白质以可溶解的形式表达的肽,也就是说,融合伴体可包括i)泛素切割位点,氨基酸序列可被泛素切割酶在其C-端切割,如泛素、泛素的部分和由它们获得的肽,及ii)在泛素切割位点的N-端的使融合蛋白质以可溶解的形式表达的肽或其变体,如谷光甘肽S转移酶、麦芽糖结合蛋白或硫氧还蛋白。
在本发明的一种实施方式中,融合伴体中的至少一个氨基酸可被替换、缺失或插入以使等电点的差异至少为1。
融合伴体可包括电荷可以发生变化的肽,电荷的变化可通过包含在融合伴体的N-端或内部位点具有与感兴趣的蛋白质不同的电荷的氨基酸序列实现。与感兴趣的蛋白质具有不同的电荷的氨基酸序列可以是包含至少一种选自His,Lys和Arg的氨基酸的氨基酸序列。优选,该氨基酸序列可以是由2-30个氨基酸组成的肽,如多聚组氨酸、多聚赖氨酸和多聚精氨酸。
或者,与感兴趣的蛋白质具有不同的电荷的氨基酸序列可以是包含至少一种选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸的氨基酸序列。
优选,该氨基酸序列可以是由2-30个氨基酸组成的肽,如多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸等。例如,融合伴体可以包括泛素、泛素的部分或其变体、及包含泛素或泛素切割位点的合成肽,其包括在N-端或内部位点具有与感兴趣的蛋白质不同的电荷的氨基酸序列。
这里,名词“具有与感兴趣的蛋白质的电荷不同的电荷的氨基酸序列”意思是在融合蛋白质或感兴趣的蛋白质的纯化过程所使用的pH条件下具有与感兴趣的蛋白质的电荷不同的电荷的氨基酸序列,因而在感兴趣的蛋白质和融合伴体之间产生对基质的吸附差异。如果感兴趣的蛋白质的pH是已知的,就有可能设计出产生电荷差异的氨基酸序列。
例如,当感兴趣的蛋白质具有7或更低的等电点时,可以使用连续连接至少两个带正电荷的氨基酸,如Lys和Arg的氨基酸序列。当感兴趣的蛋白质具有7或更高的等电点时,可以使用连续连接至少两个带负电荷的氨基酸,如谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸序列。
具有与感兴趣的蛋白质的电荷不同的电荷的氨基酸序列可以位于融合伴体的N-端或内部位点。通过改变融合伴体的电荷容易地改变融合伴体和感兴趣的蛋白质对基质,如离子交换树脂的吸附程度是可能的。
,细胞提取物中的核酸和内***也显示出低的等电点分布。因此,通过感兴趣的蛋白质与高pI的融合伴体的结合将融合蛋白质与来自于细胞的污染物分离是可能的。
例如,,因此根据等电点的差异使用离子交换树脂或薄膜将弱酸性的感兴趣的蛋白质与污染物质如核酸、内***和宿主细胞的蛋白质分离是困难的。在这种情况下,通过用在泛素的N-端或内部位点插入的阳离子肽尾修饰泛素以产生包含修饰的泛素和感兴趣的蛋白质的融合蛋白质从而增加融合蛋白质的pI是可能的。因此,可轻易地将融合蛋白质与来自于宿主细胞的污染物质分离。
另外,包括离子型氨基酸的尾可以被连接到泛素的N-端以产生感兴趣的蛋白质和要被泛素切割酶切割的融合伴体之间的等电点差异。此外,泛素可以通过替换至少一个泛素的氨基酸,或通过向其中插入一个离子型氨基酸进行修饰。
本发明的融合伴体可以是至少一个位于泛素的三级结构的表面上的氨基酸可被替换而具有不同的电荷的修饰后的泛素。例如,至少一个位于泛素的三级结构的表面上的氨基酸可以用至少一个选自His、Lys和Arg的氨基酸,或至少一个选自Glu和Asp的氨基酸替换。
参照如图1中所示的泛素的三级结构(Vijay-Kumaretal.,JMolBiol,(1987)),可以选择适宜被替换的氨基酸。在融合伴体中可被替换的氨基酸满足氨基酸的替换改变泛素的表面电荷的要求,而为了使泛素切割酶在替换后识别融合蛋白质不改变泛素的三级结构。被替换的氨基酸在二级结构中可以从位于环上但不在α-螺旋和β-片的二级结构中,且位于三级结构的表面上的氨基酸选择。
融合伴体可以选自至少一个选自包含Glu16、Glu18和Glu64的组中的位点上的氨基酸可被替换的修饰后的泛素。优选在Glu16、Glu18和Glu64上的氨基酸可分别被His、Lys和Arg替换。
在本发明中,名词“细胞提取物”包括含有包含感兴趣的蛋白质的融合蛋白质的细胞溶解物和培养物溶液。
本发明提供了一种使用融合蛋白质分离感兴趣的蛋白质的方法。
另外,本发明提供了一种从融合蛋白质中分离感兴趣的蛋白质的方法。包括a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质;b)将融合蛋白质加载在融合伴体可以吸附的基质上;c)用泛素切割酶处理吸附的蛋白质;及d)从基质上洗脱被切割的感兴趣的蛋白质。
本发明还提供一种从融合蛋白质中分离感兴趣的蛋白质的方法,包括a)在宿主细胞中表达包含感兴趣的蛋白质和融合伴体的融合蛋白质;

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