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专利名称:从粘质沙雷氏菌分离的s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列及表达重组菌株的制作方法
技术领域:
本发明属于生物技术和酶工程领域,更具体地,本发明涉及一种粘质沙雷
氏菌(5"err^ia历arcMce/7s)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)及其编码基因,以及表达metK酶的重组菌株。
背景技术:
群体感应(Quorumsensing)这个术语,是由Fuqua等1994年首先提出的。其定义是当细菌的数量达到一定的密度(quorum)时才能发生的感应现象(sensing)。当一个特定的环境中细菌的数量急剧增加时,由细菌所分泌的信息分子的浓度也会相应的升高。通过扩散性信号小分子(又称为自诱导物)与转录活化蛋白的相互作用而打开与细胞群体密度有关的基因表达。这些信号分子从细菌细胞扩散到环境中,一旦达到一个临界浓度(或者说达到某一特定的群体密度),这些信号分子就可诱导调节一系列目标基因的转录,从而在菌群范围内控制其行为。群体感应在细菌中广泛存在,胞间交流可发生在细菌种内和
种间,细菌和其真核宿主间。在革兰氏阴性菌中,自诱导物通常是
f酰基高丝氨酸内酯(AHLs),它可调节的功能包括抗生素合成、毒性因子产生、胞外多糖合成、细菌丛集、质粒结合转移、生物膜形成、接合、孢子形成、生物发光和稳定期进入等。
粘质沙雷氏菌能产生多种具工业应用潜力的物质,如壳质酶、蛋白酶、脂酶、核酸酶、抗生素、表面活性剂等;并可发酵产生大量内消旋2,3-丁二醇,灵菌红素;可利用碳源广,如单糖、蔗糖、甘油、纤维二糖等;是***酸、琥珀酸等有潜力的高产菌种;是兼性厌氧菌,在厌氧条件下,作为发酵工业菌株具有节能优势。RobVanHoudt等人利用粘质沙雷氏菌MGlQS突变株,通过检测2,3-丁二醇的前体-乙偶姻,论证了QS在2,3-丁二醇代谢合成中的生理作用。结果表明,在邵71突变株中,2,3-丁二醇以及前体联乙醯和乙偶姻产量都会大大降低。当添加C4-HSL和3-oxo-C6-HSL时,突变株中三种化合物的产量水平能够恢复到与野生型菌株一样。突变株的发酵结果和突变株
比较一致。QS系统的失活导致了在指数生长末期和稳定期酸性化合物的不断产生,并且在利用糖发酵时,会引起早期生长停滞。Rice等人建立的在基本培养基中添加葡萄糖和酪素考察生物膜变化的模型也说明了QS系统对沙雷氏菌的代谢调节功能。尽管QS系统调控2,3-丁二醇合成的精确机制还不清楚,但是QS系统方面的工作对于研究细菌代谢将会有很重要的意义。
群体感应系统对粘质沙雷氏菌的次级代谢也具有重要的调控作用。很多沙雷氏菌菌株产生灵菌红素,灵菌红素是一种次级代谢的红色抗生素,它的生物合成是由一个涉及高丝氨酸内酯群体感应系统和p&基因簇的复杂网络调控,同时,这个调控网络至少有两个单独的双组分信号转导系统和大量的其它调节因子。Sarah等人将5)^274的/7/g基因簇导入不产色素的粘质沙雷氏菌12(5"历a12)中,结果5fej12产生了红色素,并且是受自身aHSL-QS和7i/;S系统的调节。反过来将aHSL-QS调节基因座从5"历a12导入5"历a274发现,6)z/a274表现出由aHSL控制的一系列生理行为,包括红色素的产生。QS调控系统、复合调节网络以及环境信号对灵菌红素合成的影响被广泛的研究。
在沙雷氏菌S39006中,灵菌红素和碳(杂)青霉烯是由以BHL和冊L为信号分子的S/^I/R型的QS系统调控的,在沙雷氏菌SS-1中,灵菌红素的合成、核酸酶的分泌以及游动性是由^p/7lR型的QS系统调节的。在不产生色素的MG1菌株中,游动性、蛋白酶的分泌和生物膜的形成受aHSL-QS控制。5"历aluxS突变株表现出了灵菌红素产量减少、溶血和致病性降低,这都是由代谢缺陷引起的,由此说明Zd/W在激活***循环中具有代谢功能。在S/ra12突变体中,甲壳酶的分泌、细菌素的生成以及溶血活性都是由QS控制的。在
S历a12的调控体系中,S历3R的作用有待进一步确认。一些学者认为,5历aR结合所有它调节的基因的启动子;一些人则认为5历aR依赖阻抑和aHSL型脱阻抑有关的保守调节子发挥作用。这种调节蛋白具有保守的启动子元件,在aHSL存在时,5"历sR能结合它,阻止转录。还有一些理论认为在QS系统控制下的多效调节子调控灵菌红素和碳(杂)青霉烯的合成,例如在菌株S39006中,Rap受QS控制,从而影响代谢。
尽管目前本领域对于粘质沙雷氏菌在工业上的用途有所了解,然而还需要进一步清楚地研究其生理或代谢功能,找到一些对于调节生理或代谢有用的基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自于粘质沙雷氏菌的s-腺苷甲硫氨酸合成
酶(MetK)及其编码基因,含有所述编码基因的载体以及含有所述载体的重组菌株。
本发明的目的还在于提供一种从粘质沙雷氏菌的基因组中分离S-腺苷甲硫氨酸合成酶编码基因的方法。
在本发明的第一方面,提供一种分离的s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽,该多
肽选自下组
(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽;
(b)将SEQIDN0:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或
添加而形成的,且具有合成s-腺苷甲硫氨酸功能的多肽。
在另一优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子量为41850道尔顿。在另一优选例中,所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶来源于粘质沙雷氏菌。在另一优选例中,该多肽是具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面,提供一种分离的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列选自下组
(a)编码所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中,该多核苷酸编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中,该多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的序列。在本发明的第三方面,提供一种载体,它含有所述的多核苷酸。在本发明的第四方面,提供一种遗传工程化的宿主细胞,它含有所述的载体。
在本发明的第五方面,提供所述的多肽的制备方法,该方法包含(a)在适合表达的条件下,培养所述的宿主细胞;(b)从培养物中分离出S-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽。
在本发明的第六方面,提供一种从粘质沙雷氏菌基因组中分离s-腺苷甲硫
氨酸合成酶的编码基因的方法,所述的方法包括
(1)用限制性内切酶HindIII消化粘质沙雷氏菌基因组DNA,从消化产物中分离3-5kb的DN***段,并使这些DN***段自身环化连接,形成自身环化分子;
(2)以步骤(l)获得的自身环化分子为模板,以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示序列的引物进行PCR扩增,收集分子量约1155士50bp的扩增产物;
(2)对步骤(2)获得的扩增产物进行测序验证,获得含有完整阅读框的
基因,即为s-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因。
在另一优选例中,在步骤(1)中,自身环化连接的温度是12'C。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了利用简并引物扩增的Met基因的部分片段,泳道M为标准DNA分子量,自上向下的条带分别为(kb):2,1,,,,。
图2显示了鹏"基因的反向PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳,其中泳道CK为阴性对照;泳道M为标准DNA分子量,自上向下的条带分别为(kb):,,,,,,,。
图3显示了历etvf基因的SouthernBlot鉴定。
图4显示了历e"结构基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳;泳道M为标准DNA分子量,自上向下的条带分别为(kb):2,1,,,,。图5显示了重组质粒pETmetK的图谱。
图6显示了重组质粒pETmetK双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳;M为标准DNA分子量,自上向下的条带分别为(kb):2,1,,,,。
图7显示了￡co//BL21(DE3)/pETmetK诱导表达后的全菌体SDS-PAGE电泳图;泳道M为标准蛋白分子量,自上向下的条带分别为(kDa):,,,,,,。
具体实施例方式
本发明人经过长期的研究和反复的试验,首次从粘质沙雷氏菌中分离获得一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MetK)基因,经鉴定MetK是粘质沙雷氏菌QS系统关键酶。该MetK酶的获得通过设计特殊的引物,通过对粘质沙雷氏菌基因组DNA进行特殊的处理,以及通过常规PCR和反向PCR相结合的方法而克隆获得。在此基础上完成了本发明。
更具体的,本发明的提供了一种从粘质沙雷氏菌中分离的MetK酶及其结构基因、重组质粒和转化重组菌体。同时本发明提供了一种方法,即通过分子生物学手段,将本发明涉及的酶基因克隆到其他受体菌,由其他菌株或在其他培养条件下产生本发明涉及的
MetK酶。
本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因是从粘质沙雷氏菌中分离获得的,分离方法如下
(1)用限制性内切酶HindIII消化粘质沙雷氏菌基因组DNA,从消化产物中分离3-5kb的DN***段,并使这些DN***段自身环化连接,形成自身环化分子;
(2)以步骤(l)获得的自身环化分子为模板,以SEQIDN0:5和SEQIDNO:6所示序列的引物进行PCR扩增,收集分子量约1155土50bp的扩增产物;
(2)对步骤(2)获得的扩增产物进行测序验证,获得含有完整阅读框的基因,即为S-腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因。
在上述方法中,限制性内切酶的选择是重要的,本发明人发现,选择HindIII酶以外的其它限制性内切酶消化粘质沙雷氏菌基因组DNA无法获得量较多的3-5kb的DN***段,获得从酶切产物中无法良好地扩增获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
并且,在酶切后,将自身环化连接的温度设置为12°C,该温度可获得连接较好的自身环化分子,用于后续作为PCR扩增的模板。而采用常规的连接温度如16"C,自身环化连接的效果不够理想。
上述方法中,采用SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示序列的引物进行PCR扩增,该PCR扩增为反向PCR扩增。
在本发明的实施例中,本发明人利用PCR技术(反向PCR和普通PCR)和分子杂交相结合的方法成功克隆了粘质沙雷氏菌QS系统关键酶基因i/etf,同时
8利用pET28a")表达载体,表达分析了这一个基因,蛋白分子量的大小与预测的分子量基本一致。^e"关键酶基因的克隆为深入研究QS调控系统遗传特点以及研究QS系统在代谢中的功能奠定了基础。
如本文所用,"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,"分离的s-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或多肽"是指s-腺苷甲
硫氨酸合成酶多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物
质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化s-腺苷甲硫氮酸合成酶
蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰***凝胶上能产生单一的主带。s-腺苷甲硫氨酸合成酶多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本
发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
在本发明中,"S-腺苷甲硫氨酸合成酶保守性变异多肽"指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比,有至多3个,较佳地至多2个,更佳地至多l个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:l所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质,但与SEQIDNO:l所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。