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从白桦的叶片诱导不定芽的培养基的制作方法.docx

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专利名称:从白桦的叶片诱导不定芽的培养基的制作方法
技术领域:
本发明属于生物工程技术,具体的讲,本发明属植物生物技术的白桦生物技术。
目前,白桦作为林木细胞工程模式种,其组织培养技术一直为国内外学者所关注。从七十年代末起,国外就开始对白桦的组织培养进行研究。Huhtiren等人于1974年,Mccrown等人于1979年分别对欧洲白桦(Betulapendula)和美洲桦()组织培养获得成功。我国的桦树离体培养工作开始于九十年代。有关白桦()的组织培养报道仅发表在1999年东北林业大学学报上,其中陶静、詹亚光等人发表了白桦组织培养的研究,详细报道了有关白桦的组织培养技术。他们利用腋芽完成了白桦的快繁成功,但并没有利用叶盘外植体建立起再生体系。
本发明的目的在于提供一种适合于白桦的叶盘组织培养的培养基。
为了达到上述目的,本发明采用的技术方案是在由***钾、***铵、七水硫酸镁、二水***化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、五水硫酸铜、碘化钾、二水钼酸钠、乙二***四乙酸二铁、六水***化钴、烟酸、肌醇、盐酸硫***、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖组成MSB5培养基的基础上还增加6
-BA、NAA及IBA。
MSB5培养基配方为
本发明的优点是该培养基诱导率高,增殖率高,可以在较短的时间内得到大量的再生苗,建立优良的再生体系,并为根癌农杆菌的转化提供了保障。
下面对本发明的实施例作详细的描述。
该培养基的组成成分是***钾、***铵、七水硫酸镁、二水***化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、五水硫酸铜、碘化钾、二水钼酸钠、乙二***四乙酸二铁、六水***化钴、烟酸、肌醇、盐酸硫***、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖组成MSB5培养基的基础上还增加6-BA、NAA及IBA,本发明的特征是在原来MSB5培养基基础上增加了6-BA、NAA及IBA,在世界上首次建立起白桦的叶盘再生体系。
MSB5培养基配方为
所述的诱导培养基MSB5+6-++40g/l蔗糖+-;所述的伸长培养基MSB5+6-++40g/l蔗糖+-;
所述的生根培养基1/2MSB5++40g/l蔗糖+-。
各种培养基配置时除添加以上成分外,,分装后在121℃,;所述的生根苗移栽的条件的环境湿度应保持在
90—100%或过饱合状态,光照温度保持在500—800Lux。
MSB5培养基配方为
应用以上培养基,用白桦叶盘接钟在该培养基上,一个月可以产生不定芽。转移到伸长培养基里培养,并继代一次,然后转入生根培养基即可诱导生根。待生根苗生长健壮后,即可进行移栽,经温室培养两周,逐渐移至苗圃培养。
本发明用白桦(Betulaplatyphylla)的叶盘进行培养,取得成功,叶盘来源于腋芽再生苗、下胚轴再生苗和茎段再生苗,这些再生苗的基本培养基为改良的WPB5,具体操作如下WPB5培养基配方为
1、腋芽再生苗叶盘的获得于12月至次年3月从生长健壮、无病虫害的优树上采集枝条,保存于4℃冰箱。接种前将枝段在室温下水培7—10天,待芽萌动后即可用于接种。将萌动芽取下后,在表面活性剂的作用下用自来水冲洗,除去表面灰尘,然后用70%乙醇消毒1min。在超净工作台中用5%次***酸钠处理10min后可进行接种。
腋芽可以通过腋芽生枝和愈伤两种途径进行增殖。腋芽生枝途径的培养基成分如下起始培养基WPB5(WP大量+WP微量+B5有机物)++20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-++
20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-。
2、下胚轴再生苗叶盘的获得9日龄下胚轴接入诱导培养基后,7天端部开始膨大,20天后形成各种愈伤组织。将愈伤组织从外植体上切下,在继代培养基中培养30天后,转入分化培养基,20天后愈伤组织开始分化出再生苗。再生苗离体培养三代后的叶盘可以用于再生培养。
获得下胚轴再生苗的培养基如下愈伤诱导培养基WPB5++20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-、茎段再生苗叶盘的获得茎段接入诱导培养基7天后两端开始膨大,逐渐形成绿色致密愈伤,30天后将愈伤从茎段两段切下,经过30天继代培养后,将愈伤转入分化培养基。20天后愈伤分化出再生苗,再生苗离体培养三代后,叶盘可用于再生培养。
愈伤诱导培养基WPB5+++20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-+
+20g/l蔗糖+-++20g/l蔗糖+-,,将叶盘向轴面朝下接种于诱导培养基,一个月后将诱导出的不定芽从边缘切下转入伸长培养基,在伸长培养中继代一次后,—2cm直径为1mm时,将再生苗转入生根培养基,经过3—4周培养小苗已具有了发达、健壮的根系,苗茎已木质化,此时即可进行移栽。
将生长健壮的生根试管苗除去棉塞在温室进行3天左右的炼苗,使试管苗适应环境的湿度。移栽前将再生苗从三角瓶中取出,洗去根上粘有的培养基,栽入温室进行培养,浇透水。试管苗移栽初期对环境要求严格,环境湿度应控制在90%,光照强度为5000Lux左右,才能保证移栽的成活率。
叶盘再生培养基如下诱导培养基MSB5+6-++40g/l蔗糖+-+6-++40g/l蔗糖+-++40g/l蔗糖+-
权利要求
,其特征在于在由***钾、***铵、七水硫酸镁、二水***化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、五水硫酸铜、碘化钾、二水钼酸钠、乙二***四乙酸二铁、六水***化钴、烟酸、肌醇、盐酸硫***、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖组成
MSB5培养基的基础上还增加6—BA、NAA及IBA。MSB5培养基配方为
,其特征在于所述的培养基配方还包括a、诱导培养基MSB5+6-++40g/l蔗糖+-;b、伸长培养基MSB5+6-++40g/l蔗糖+-;c、生根培养基1/2MSB5++40g/l蔗糖+-。
,其特征在于生根苗移栽的条件的环境湿度应保持在90—100%或过饱和状态,光照强度保持在500—8000Lux。
全文摘要
一种从白桦的叶片诱导不定芽的培养基,由***钾、***铵、七水硫酸镁、二水***化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、五水硫酸铜、碘化钾、二水钼酸钠、乙二***四乙酸二铁、六水***化钴、烟酸、肌醇、盐酸硫***、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖组成MSB