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从生物反应器中回收酶的制作方法.docx

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专利名称:从生物反应器中回收酶的制作方法
从生物反应器中回收酶本发明涉及利用沸腾床吸附(EBA)系统使用亲和力捕捉从生物反应器中回收酶。生物上制备的醇,如最常用的乙醇以及不太常用的丙醇和丁醇,是由微生物和酶通过糖或淀粉(最简单的过程)或纤维(其更为复杂的过程)的发酵来制备的。经常要求提供生物丁醇(也称作生物汽油)直接替代汽油,因为它可以直接用于汽油发动机中(与在柴油发动机中的生物柴油相类似的方式)。乙醇燃料是全世界最常见的生物燃料,尤其在巴西。乙醇燃料可以通过来自小麦、玉米、糖用甜菜、甘蔗、糖蜜以及可以制备酒精饮料(如土豆和水果废弃物等)的任何糖或淀粉糖的发酵来制备。所采用的乙醇制备方法是酶解(从储藏的淀粉中释放糖)、糖的发酵、蒸馏和干燥。可以从纤维素中制备的乙醇的潜在量超过大于从玉米中可制备的乙醇的数量级。与玉米转化为乙醇相比,纤维素转化为乙醇的路径涉及很少或者没有促成温室效应,并且具有明显的正净能量平衡。由于这种考虑的结果,近几年代谢纤维素的微生物已经突出出来。木质纤维素是难以水解的,因为:(i)它与半纤维结合、(ii)它被具有与半纤维有限的共价结合的木质素密封包围、以及(iii)大部分木质纤维素是具有潜在地形成六个氢键(四个分子内氢键和两个分子间氢键)以赋予其高度有序、紧凑排列的结构的晶体结构。预处理的目的是通过
(i)去除木质素密封、(ii)溶解半纤维素、(iii)扰乱结晶度、和/或(iv)增加孔隙体积来增加纤维素的表面面积。攻击结晶纤维素的纤维素酶体系的价值在于观察到许多增加表面面积的预处理同样增加结晶度。这些包括稀硫酸、碱以及乙二***。在将纤维素转化为燃料中的限速步骤是它的水解,尤其是最初攻击高度有序的、不可溶结构的结晶度纤维素,因为该攻击的产物是容易溶解并且转化为糖。在将纤维素转化为糖的方法的开发上进行了大量的努力。这些工作的大多数强调生物化学、遗传学和预处理方法的过程开发以及酶分解。生物燃料制备受到低生产经济效应的限制,部分是由于用于溶解生物质和将聚合物碳水化合物转化为可发酵的糖的酶(纤维素酶、木聚糖酶、木质酶及其他)的成本。通常需要平衡所使用的酶的量以达到相对于与使用高的酶浓度有关的成本最大产率的生物燃料产品(即:通过添加更多的酶来实现更高的生产率,但是这样做增加成本是禁止的)。所涉及的酶,即纤维素酶、木聚糖酶、木质酶及其他的酶是高价的。然而,目前的实践是不能回收并且再利用在所述方法中所使用的酶。本发明人已认识到:希望在消化过程的最后回收酶以使它们可以被再利用。这是因为酶回收的应用通常不仅降低酶的成本,而且使更高的生物燃料产品产量和改进的收益率成为可能。在消化过程中的生物质是非常多变的来源,并且将会由可溶的、部分可溶的和不可溶的材料组成。只有一部分的生物质将会转化为二糖或单糖,留下可溶的或不可溶的材料的混合溶液。从这些混合物中提取消化酶酶存在艰难的挑战,因为传统的分离技术如膜过滤或填充床色谱不能处理大量的不可溶材料而没有出现污染和流动堵塞。此外,为了可以从消化过程完成之后剩下的混合物中回收酶而没有破坏酶的活性和
/或有用性,有必要选择可以在不会导致酶变性或失活的温和条件下进行的提取方法。本发明提供一种进行酶加工的方法,其中,所述酶被回收且再利用于至少所述加工的二次重复中,其中所述加工的每次重复包含以下步骤:(a)提供多相的底物溶液,在该溶液中,所述底物是完全可溶的、部分可溶的或不可溶的;(b)将酶或酶的混合物添加到所述多相的底物溶液中;以及(c)使所述底物进行酶反应;其中,在完成对每次重复的步骤(C)之后,根据以下步骤从由步骤(C)所获得的混合物中回收酶:(d)进行非填充床吸附过程,其包含将所述反应混合物与吸附该酶的吸附剂接触,以便从由步骤(C)所获得的反应混合物中分离酶;(e)任选地从所述吸附剂中洗涤非结合的材料;以及(f)从所述吸附剂中解吸酶;以及进一步,其中将在步骤(f)中所获得的解吸后的酶用于所述加工的至少一次随后重复的步骤(b)中。优选地,所述过程至少进行二次重复,例如三次、五次或十次重复。优选地,如果有必要添加额外的酶以维持在多相的底物溶液中所希望水平的酶活性,补充用于二次及随后重复中的回收酶,因为预料到从反应混
合物中经时回收酶是没有完成的,并且所回收的酶的活性将会随着使用而降低。补充的酶可以是先前使用的和回收的酶,或者可以是“新鲜的”,即先前没使用过的酶。合适地,所述方法可以进一步包括将从在水溶液中的步骤(f)的吸附剂获得解吸后的酶并且将所述水溶液进行超滤以提供浓缩的酶溶液和水的步骤。这提供另外的经济上和环境上的益处,即用于回收酶的水可以循环,例如,用于解吸来自吸附剂的另外酶。合适地,本发明的吸附步骤(d)可以与对由步骤(C)所获得的混合物进行的其他过程同时进行。例如,如果所述过程形成制备生物燃料的一部分,则可以进行吸附步骤(d),同时还进行在步骤(C)中所制备的糖的发酵。各种非填充床色谱是众所周知的,且可以用于本发明。填充床色谱法由于当多相溶液,即含不溶材料的一种多相溶液穿过填充柱时有吸附剂堵塞填充柱的倾向,而被认为是不适合的。然而,可以合适地使用如下方法以及在本技术领域中众所周知的其他方法:将一容器反应混合物与吸附剂接触;允许发生酶的吸附;并且随后将吸附剂与容器分离(如通过过滤)的方法。然而,优选通过沸腾床色谱进行本发明的步骤(d)。沸腾床色谱(EBA)是对进行亲和分离步骤以从未分级的原料中捕获特定材料来说是成功的方法。在这方面,它非常适合从生物质消化过程中捕获和回收高价值的酶。将在
EBA柱上待加工的材料可以定义为在完成消化过程之后含未消化的材料和可溶的消化产品的多相溶液,这是包含大于
%体积/体积的不可溶物质的水溶液。合适地,步骤(d)作为批过程来进行。适当地,步骤(d)可以使用含高密度颗粒、低密度颗粒或磁性颗粒的吸附剂,或者可以使用膜吸附过程。用于酶加工的底物可以是:纤维素或含纤维素的材料如木材或稻草;来源于玉米、小麦或藻类的淀粉基材料;来源于油料籽、油菜籽、向日葵、麻风树或藻类的含油材料;或不可溶或部分可溶的植物蛋白溶液。含生物质的多相溶液或悬浮液还可以包含有机溶剂或离子溶剂。如果是这样的情况,则在这些条件下必须采用酶活性进行消化步骤(C)。类似地,必须选定吸附步骤(d)中的酶的吸附剂以使该吸附剂在有机或离子液体中是稳定的。用于本发明方法中的合适酶包括纤维素酶、木聚糖酶和木质酶。这些酶可以是自然声称的或可以被设计为具有所想要的特性。优选地,标记酶或酶的混合物以增强与吸附剂结合的特异性和/或酶强度。优选地,基因或化学修改用于本发明的酶以便可以通过特定的吸附剂更有效地捕获它们。合适的标记方法和化学基团包括:引入与固定的金属螯合剂或可以特异性设别的其它特异性肽序列相互作用的His6标签,或该His6标签结合至固定的部分如染料,例如,辛巴蓝(CibacronBlue)。用染料标记酶和吸附剂并且采用桥联分子如白蛋白以实现固定;用染料标记酶,通常这可以在间隔分子如葡聚糖或聚乙烯醇的末端标记,并且标记后的酶可以结合到固定在吸附剂上的白蛋白;将特异序列结合至含将结合到在吸附剂上固定的互补序列的
DNA低聚物或类似物如PNA或LNA的酶;采用碳水化合物部分或乙酰化、琥珀酰化、烷基化或还原性氨基化改性酶;以及亲和标记酶如通过生物素、活性染料或硼酸、螯合基团如IDA、环糊精、聚乙二醇或具有附着配体的葡聚糖。`优选的方法是用特异性配体如荧光素标记酶;以及将配体特异性抗体如荧光素特异性抗体固定在吸附剂上,随后通过降低PH值以反转抗体/配体的相互作用来洗脱。这有利于使用低成本的抗体源如植物源材料或“植物抗体”。可选择的方法是改性酶以实质性改变等电点(pi)而没有实质性降低酶活性,使得该Pi不同于在消化过程中存在的其他蛋白质。因此,在选择用于色谱捕获步骤的PH值条件下,改性后的酶将会通过吸附剂结合,并且将会可忽略其他蛋白质的结合。优选地,吸附剂将是离子交换剂,并且洗脱结合酶将会通过改变洗脱缓冲液的PH值来实现。另外的方法是使用固定的酶底物作为吸附剂,其中酶以足够高的亲和力结合到活性位点以允许捕获来自消化液中的酶。另外的方式是用铁磁性的、顺磁性的或超顺磁性的物质如葡聚糖涂覆的氧化铁纳米颗粒或微粒、或能够强结合到酶的其他聚合物磁性材料结合物来标记酶。另外的方法是在直接与消化液体中的酶结合的吸附剂上使用合成的配体以结合至被插入与配体特异性相互作用的酶氨基酸系列的域;或者结合至已经通过化学衍生而引入的部分。然后,可以随后使用合适改变的条件如
PH值或离子强度,将结合的酶从吸附剂上释放出来。在EBA过程中,流速、颗粒大小和颗粒密度都对流化床的膨胀影响,并且通过将颗粒保持在柱内部的方式控制膨胀度是重要的。膨胀度可以由Η/Η0来定义,其中,HO是在填充床模式中的床的高度,H是在膨胀模式中的床的高度。在本发明优选的实施方式中,膨胀度Η/-20范围内,-10,-6;-5,-4;例如4-6;例如
3-5,如3-4;例如4-6。在本发明另外优选的实施方式中,膨胀度Η/,,至少如2;,如至少3;,如至少4;;如至少5;,如至少6;例如至少10,如至少20。发现EBA吸附剂颗粒的密度对与在代表性的EBA柱中可能的吸收床最大膨胀度(如H/HO最大值3-5)有关的合适流速是很重要的,,,,,。吸附剂颗粒的密度就是描述吸附剂在其完全溶剂化(如水化的)状态的密度,其干燥的吸附剂的密度相反。在本发明的优选的实施方式中,吸附剂具有平均粒径最大为150μm,优选最大为
120μm,更优选最大为100μm,更优选最大为90μm,更优选最大为80μm,更优选最大为70μm。代表性的吸附剂颗粒具有平均粒径在40-150μm范围内,例如40-120μm,如40-100;例如40-75,如40-50μm。在优选的实施方式的组合中,如果平均粒径是120μm或更小,,。当平均粒径小于90μm时,
。当平均粒径小于75μm时,/。在很大程度上,吸附剂颗粒的高密度是通过包含一些比例的致密无孔芯材来实现,,。通常,-25g/ml范围内的密度,,;例如12_19g/ml,如14-18g/ml;-,-10g/ml。含酶的混合物可以应用到线速为至少3cm/min,例如至少5cm/min,如至少8cm/min;例如至少10cm/min,如20cm/min的吸附剂柱上。代表性的流速是选自在5_50cm/min范围内,例如在5_30cm/min范围内,如10_30cm/min范围内;例如25_50cm/min范围内。由于吸附剂颗粒的小尺寸,在很大程度上增加流速是可能的,因此将消化的生物质和酶应用于吸附剂柱的应用具有至少200cm/hr;例如至少300cm/hr,更优选至少400cm/hr;例如至少
500或600cm/hr;例如至少900cm/hr的线速。在本发明的特别优选实施方式的组合中,如果在应用消化的生物质材料期间所应用的线流速大于300cm/hr,则优选的平均粒径小于150μm。代表性地,在其中以线流速大于500cm/min进行酶回收过程的实施方式中,平均粒径小于120μm,优选小于90μm。代表性地,在其中以线流速大于600cm/min进行酶回收过程的实施方式中,平均粒径优选小于85μm,更优选小于75μm。根据本发明采用的吸附剂颗粒优选至少部分可渗透待回收的酶以确保其与不可渗透的颗粒相比显著的结合能力,所述不可渗透的颗粒仅可在它的表面结合目标分子,导致相对低的结合能力。吸附剂颗粒可以具有大量的不同结构、组合和形状。因此吸附剂颗粒可以由大量化学衍生的、具有必要的密度和结合力的多孔材料组成,以便在给定的自身流速下操作。所述颗粒是如在W01092/00799中描述的团聚物型,其具有至少两个被多孔材料包围的无孔芯材;或具有被多孔材料包围的单一无孔薄膜芯材型。在本文中,术语“团聚物型”涉及颗粒状材料的颗粒,其包含可以是不同类型和大小的芯材被聚合物基基材结合在一起的珠状材料,例如,由被包围的琼脂糖结合在一起的两种或更多种高密度颗粒组成的芯颗粒。在本文中,术语“薄膜型”涉及复合物颗粒,其中每个颗粒仅由被涂覆有多孔聚合物基基材层的高密度芯材组成,例如,用琼脂糖涂覆的高密度不锈钢珠。因此,术语
“至少一种高密度无孔芯材”涉及包含单一高密度无孔颗粒的薄膜芯材;或者它涉及包含多种高密度无孔颗粒的团聚无型芯材。如上所述,吸附剂颗粒包含具有包围芯材的多孔材料的高密度无孔芯材,并且所述多孔材料在它的外表面任选地包含配体。在本文中,术语“芯材”涉及无孔芯材颗粒或在吸附剂颗粒内存在的芯材颗粒。芯材颗粒可以随机地分散在多孔材料中并且不限于位于吸附剂颗粒的中心。通常无孔芯材构成该吸附剂颗粒的总体积的最多50%,如最多40%,优选最多30%。合适的无孔芯材料的实例是无机化合物、金属、重金属、非金属元素、金属氧化物、非金属氧化物、金属盐、金属合金等,只要满足上述密度标准。这些芯材料的实例是金属硅酸盐、金属硼硅酸盐;陶瓷,包括二硼化钛、碳化钛、二硼化锆、碳化锆、碳化钨、碳化硅、氮化铝、氮化硅、氮化钛、氧化钇、金属硅粉末、以及二娃化钥(molybdenumdisilide);金属氧化物和硫化物,包括镁、招、钛f凡、铬、锆、铪、锰、铁、钴、镍、铜和银的氧化物;非金属氧化物;金属盐,包括硫酸钡;金属元素,包括鹤、错、钛、铪、银、铬、猛、铁、钴、镍、铟、铜、银、金、钮、钼、钌、锇、错和铱,以及金属元素的合金,如所述金属元素之间形成的合金,例如不锈钢;结晶或非晶形式的碳,包括石墨、炭黑和木炭。优选的无孔芯材料是碳化钨、钨、钢和钛珠如不锈钢珠。多孔材料是用作覆盖芯材的聚合物基基体,并且如果必要,将多个