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从烟草克隆细胞色素p450基因的制作方法 2.docx

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从烟草克隆细胞色素p450基因的制作方法 2.docx

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专利名称:从烟草克隆细胞色素p450基因的制作方法
技术领域:
本发明涉及在烟草(Nicotiana)植物中编码细胞色素P450酶(下文称为P450和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列来改变植物表型的方法。
背景技术:
细胞色素P450催化各种化学上不同的底物的酶反应,包括内源性和异源底物的氧化、过氧化和还原性代谢。在植物中,p450参与包括植物产物合成在内的生化途径,所述产物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物碱、萜类、脂质、生***糖苷(cyanogenicglycoside)和葡糖异硫***酸盐(glucosinolates)(Chappel,,49311-343)。细胞色素p450也称为血红素-硫醇盐蛋白(heme-thiolateprotein),通常用作多组分电子转移链(称为含p450的单加氧酶系统)中的末端氧化酶。所催化的特定反应包括脱***化、羟基化、环氧化、N-氧化、磺基氧化(sulfooxidation)、N-、S-和O-脱烷基化、脱硫作用、脱氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基团的还原。
烟草植物p450酶的各种作用涉及产生各种植物代谢物,例如苯丙素、生物碱、萜类、脂质、生***糖苷、葡糖异硫***酸盐和其它化学物质的宿主。近年来,人们开始了解一些
p450酶影响植物中植物代谢物的组成。例如,长期以来人们希望通过育种改变植物的所选脂肪酸的特性来改善特定植物的风味和香味;然而涉及控制这些叶子组成的水平的机理知之甚少。下调与改变脂肪酸有关的p450酶可有助于积累提供更适宜的叶子表型质量的所需脂肪酸。p450酶的功能及其在植物组成中广泛的作用仍有待发现。例如,特定类型的p450酶发现可催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和醇,而主要是这些物质导致水果和蔬菜具有“新鲜翠绿”的气味。可改变其它作为新目标的p450酶的水平,通过改变烟草叶子中的脂质组成和相关的降解代谢物来提高叶子组成的质量。叶子中的几种这些成分受老化的影响,而老化刺激叶子质量特性的成熟。其它人也报道p450酶在改变涉及植物病原体相互作用和疾病抗性的脂肪酸中起作用。
在其它例子中,已提示p450酶涉及生物碱的生物合成。降烟碱是在烟草(Nicotianatabaceum)中发现的少量生物碱。推测它是这样产生的p450介导的尼古丁脱***化,然后在N位酰化和亚硝基化,从而产生一系列N-酰基降烟碱(N-acylnonicotine)和N-亚硝基降烟碱。推测的p450脱***酶催化的N-脱***化被认为是烟草中降烟碱生物合成的主要来源。尽管认为该酶是微粒体酶,但是迄今为止未能成功地纯化尼古丁脱***化酶,也未能分离到有关基因。
此外,有假说认为(但未证实)p450酶的活性受遗传控制并且也强烈地受环境因素的影响。例如,当植物达到成熟阶段后,认为烟草中尼古丁的脱***化作用大大增加。另外,有假说认为(还未证实)脱***化基因含有当存在时能抑制RNA翻译的转座元件。
在本发明之前,p450酶形式的多样性、其结构和功能的不同使得对烟草p450酶的研究十分困难。此外,对p450酶的克隆至少部分由于这些膜定位的蛋白通常存在量低且经常在纯化中不稳定而受阻。因此,需要在植物中鉴定p450酶和与那些p450酶相关的核酸序列。特别是,在烟草中仅有少许细胞色素p450蛋白已见报道。本文所述的发明发现了许多细胞色素p450片段,这些片段基于它们的序列同一性而对应于几组p450种类。
概述本发明针对植物p450酶。本发明还涉及来自烟草的植物p450酶。本发明也涉及其表达由乙烯和/和植物老化诱导的植物中的p450酶。本发明还涉及植物中具有酶活性的核酸序列,例如可分类为氧化酶、脱***酶等和其它酶,以及使用那些序列来使这些酶的表达降低和沉默和过度表达。本发明也涉及在含有较高降烟碱水平的植物而非显示较低降烟碱水平的植物中发现的p450酶。
、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、
41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在第2个相关的方面,根据它们在细胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到终止密码子的对应区域的同一性,对那些含有大于75%的核酸序列同一性的片段进行分组。代表性的核酸组和各自的种类示于表I。
在第3方面,、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、
198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296和298。
在第4个相关的方面,根据它们在细胞色素p450基序GXRXCX(G/A)后的第一核酸到终止密码子的对应区域的同一性,对那些含有大于71%的核酸序列同一性的片段进行分组。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表II。
在第5个方面,、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296和298。
在第6个相关的方面,根据彼此的同一性对那些含有大于85%和更高的氨基酸序列同一性的全长基因进行分组。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表III。
在第7个方面,-357所示片段的氨基酸序列。
在第8个相关的方面,根据它们在第一细胞色素p450结构域
UXXRXXZ到第3细胞色素结构域GXRXO的对应区域的互相同一性,对那些含有大于90%和更高的氨基酸序列同一性的片段进行分组,其中U是E或K,X是任何氨基酸,Z是R、T、S或M。代表性的氨基酸组和各自的种类示于表IV。
在第9个相关的方面,p450酶在烟草植物中的减少或消除或过度表达可使用RNA病毒系统瞬时实现。
评价得到的转化或感染的植物的表型改变,包括(但不限于)使用本领域普通技术人员常规可用的技术来分析内源性p450RNA转录物、p450表达肽和植物代谢物的浓度。
在第10个方面,本发明也涉及产生具有改变的p450酶活性水平的转基因烟草谱系。根据本发明,这些转基因谱系含有有效地特定酶表达减少、沉默或增加,从而在烟草中导致表型效应的核酸序列。、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、
255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在本发明非常重要的第11方面,与对照植物相比,含有本发明核酸的植物栽培品系在使用全长基因或其片段的下调能力或使用全长基因或其片段的过度表达能力上具有改变的代谢物特性。
在本发明的第12方面,含有本发明核酸的植物栽培品系具有对特定外源性化学物质或植物害虫耐受的用途,所述植物使用全长基因或其片段以更改来源于植物或植物以外的代谢物的生物合成或降解。、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在第13个方面,本发明涉及筛选含有与所述核酸序列具有实质核酸同一性的基因的植物,优选烟草。使用本发明有利于鉴定和选择含有精确的或实质同一性的核酸序列的植物,其中这种植物是传统或转基因品种的育种程序、诱变程序或天然存在的不同植物种群的一部分。可使用核酸探针结合核酸检
测方法,包括(但不限于)核酸杂交和PCR分析,通过评价植物的核酸物质来筛选实质核酸同一性的植物。核酸探针可由对应于以下SEQID的所述核酸序列或其片段构成SEQID1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295和297。
在第14个方面,本发明涉及鉴定与所述核酸序列具有实质性氨基酸同一性的植物基因,优选烟草。可使用核酸探针结合核酸检测方法,包括(但不限于)核酸杂交和PCR分析,通过筛选植物
cDNA文库来鉴定植物基因,包括cDNA和基因组克隆,优选烟草的cDNA和基因组克隆。核酸探针可由对应于以下SEQID的核酸序列或其片段构成1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、143、145和147。
在其它第15个方面,可使用针对部分或全部所述氨基酸序列的抗体来筛选表达肽的cDNA表达文库。这种氨基酸序列包括SEQID2、4、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、144、146、148。
在第16个重要的方面,本发明也涉及产生过度表达p450酶活性水平的转基因烟草谱系。根据本发明,这些转基因谱系包括编码全长基因的氨基酸序列的所有核酸序列,所述基因有效地增加特定酶的表达从而导致烟草中的表型效应。、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、
212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296和298。
也提供了含有降烟碱含量降低的烟叶(叶片和/或茎)的烟草产品。该烟草产品包括烟草(含有叶片和/或茎的烟叶),该烟草来自含有本文所述序列或消除或抑制了编码烟草特异性亚硝基***的基因的植物。与用未消除或抑制编码烟草特异性亚硝基***的基因的烟草植物制备的烟草产品相比,消除或抑制编码烟草特异性亚硝基***的基因有效地降低了烟草产品中约5-10%、或者约10-20%、或者约20-30%、或者30%以上的烟草特异性亚硝基***。本文使用的烟草产品可包括香烟、雪茄、烟丝、鼻烟、口嚼烟(chewingtobacco)、混合了烟草产品的产品和它们的混合物。
附图简述