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从微藻制备和提取角鲨烯的方法
本发明涉及一种以属于破囊壶菌目物种家族的微藻生产角鲨烯的方法,优选以在每100g干生物质2g与12g之间的浓度生产。该方法其特征在于它包括由以下项组成的步骤:在25℃与35℃之间、优选在28℃与32℃之间、并且更优选在大约30℃的温度下培养属于破囊壶菌目物种家族的微藻;并且向所述培养基以每升培养基添加1μg与1000μg之间的维生素B12。
【专利说明】从微藻制备和提取角鲨烯的方法
[0001]本发明涉及从破囊壶菌目物种家族的微藻通过发酵而最优化生产角鲨烯的一种方法。
[0002]出于本发明的目的,表述“破囊壶菌目物种家族的微藻”旨在指代属于裂殖壶菌属物种(Schizochytriumsp.)、Aurantiochytrium物种(Aurantiochytriumsp.)以及破囊壶菌属物种(Thraustochytriumsp.)的微藻。
[0003]角鲨烯是一种三萜烯,一种包含30个碳原子和50个氢原子的类异戊二烯,具有以下化学式:2,6,10,15,19,23-六***-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯。
[0004]它是由所有较高级别的有机体,包括人类(在皮脂中发现)天然产生的一种脂质。角鲨烯实际上是胆固醇、类固醇激素和维生素D生物合成中的一种重要的中间产物(胆固醇代谢途径的的一种酶一角鲨烯单加氧酶,通过氧化角鲨烯分子末端之一,将诱导其环化并且产生羊毛留醇,该羊毛留醇被转化成胆固醇和其他类固醇
)。
[0005]在工业上,角鲨烯尤其被用于食品部门、化妆品领域和制药领域。
[0006]作为一种食品补充剂,角鲨烯通常被配制成胶囊或者油类。
[0007]在化妆品领域中,这个分子可以用作一种抗氧化剂,在保湿霜中用作抗静电剂和润肤剂,快速渗透进皮肤而不留下脂肪痕迹或者感觉,并与其他油类和维生素类很好地混合。
[0008]在这个领域,应该注意到,由于角鲨烯非常高的不稳定性(6个不饱和状态),饱和形式的角鲨烷(通过氢化作用得到)是比角鲨烯更好的抗氧化剂,这种角鲨烷在市场上可以找到,一般具有非常高的纯度(99%)。
[0009]毒理学研究显示,按照在化妆品中使用的浓度,角鲨烯和角鲨烷都不会展示出任何毒性,并且对人体皮肤没有刺激性或者敏感性。
[0010]在制药领域,角鲨烯用作疫苗的佐剂。
[0011]这些佐剂是刺激免疫系统并且增加对疫苗的反应的物质。
[0012]自从1997年在一种流感疫苗(Fluad,来自Chiron公司,对抗季节性流感
)中以每个剂量大约10mg角鲨烯使用角鲨烯以来,角鲨烯已经以添加到接种物质中的乳剂的形式使用以便使得疫苗更易产生免疫性。
[0013]如所有含有角鲨烯的疫苗,这些乳剂具有乳白色的外观。
[0014]角鲨烯还被用作一种疫苗佐剂,特别是实验疫苗、抗疟疾物质或者靶向新出现的病毒H5N1及2009H1N1的流感疫苗的佐剂,如:
[0015]-葛兰素史克公司在对抗2009年流感流行时使用的Pandemrix和Arepanrix疫苗中的AS03佐剂系统的获专利成分,
[0016]-诺华公司使用的MF59佐剂系统的获专利成分。
[0017]角鲨烯还被添加在流感疫苗中以通过产生记忆⑶4细胞来刺激人体的免疫应答。
[0018]流感疫苗的第一个水包油佐剂已经与季节性流感病毒抗原联合上市。
[0019]角鲨烯的纯度水平在这个应用领域中是至关重要的。
[0020]实际上,如果口服使用,角鲨烯被认为是完全安全的;但是,注射途径是争议主题。[0021]实际上,在医学领域,在角鲨烯被杂质污染的情况下,对人接受者的伤害的风险增加,因为通过确定,这种佐剂还可以诱导对抗其自身杂质的强免疫应答。
[0022]因此拥有高质量的无杂质(痕量金属,特别是***,以及痕量的其他***类)的角鲨烯至关重要。
[0023]在文献中建议了一些生产角鲨烯的路径。
[0024]它是常常发现储存在软骨鱼(例如深海鲨)的肝脏中的一种化合物(因此而得名)。
[0025]因此这是它们为什么被过度捕渔的原因之一,鲨鱼已经由于其鱼鳍而被猎杀。现在又将鲨鱼的肝脏出售以生产描述为“有益健康”的凝胶胶囊。
[0026]然而,虽然上市的角鲨烯因此主要从鲨鱼的肝脏中提取,但是并非没有健康问题。
[0027]这是因为鲨鱼能被一些病原体感染,这些病原体可以产生对人体有害的物质。另外,鲨鱼的肝脏,它是有机体消除和纯化的器官,可能包含对人体有害的例如真鲨***的***类。
[0028]这些环境问题(大大降低了鲨鱼的数量)以及健康问题(鱼的肝脏还储存了涉及健康的***类)促使了从植物类的提取。
[0029]因此有可能将它从橄榄油、和棕榈油中分离,以及从来自谷物类的或者源于苋菜、种子、米糠或小麦胚芽的其他油类中分离。
[0030]但是,这种情况中的主要缺点是角鲨烯被提取出的量非常少,%%。
[0031]通常从鲨鱼肝脏或从植物类提取的这些方法由于进行大量富集和纯化过程而很昂贵,已经提出了作为这些方法的第一个替代方法,该第一个方法是从以下微生物中产生角S烯:天然酵母或重组酵母,特别是酵母菌属(Saccharomyces)类型。
[0032]由此,酿酒酵母以其产生角鲨烯的能力而为人了解,但是产生的量非常少:(巴塔查尔吉(Bhattacharjee,P.)等人,2001,《世界微生物生物技术杂志》(.)17,第811-816页)。
[0033]因此已经通过基因重组的方式进行了优化这些生产能力的工作。
[0034]产生角鲨烯的重组酵母因此具有以下优势:
[0035]-受益于与宿主细胞相同的GRAS(通常认为安全)状态,
[0036]-跟宿主细胞一样没有病原体、没有朊病毒或没有***类,以及
[0037]-已经被用在疫苗领域(例如这些表达了包含乙肝抗原的载体的酵母菌)。
[0038]然而,如专利申请W02010/023551对于医学领域所呈现的(生产纯度高于97%的角鲨烯作为疫苗佐剂),只有使得重组酵母菌超生产角鲨烯(高于菌体干重的15%)变得有可能,这第一个替代方法才可以工业化。
[0039]如果可以发生的话,获得这些重组细胞需要:进行大量的、艰苦的、冗长并复杂的代谢工程化步骤,使用分子生物学工具,导致刺激角鲨烯生物合成路径并且抑制角鲨烯的分解代谢途径。
[0040]实际上,如所述专利申请W02010/023551另外介绍的,在角鲨烯生物合成中涉及很多基因:包含甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、HMGR(3-羟基-3-甲戊二酰-辅酶A还原酶)以及角鲨烯合成酶。
[0041]对于分解代谢途径,基因编码在角鲨烯转化成麦角固醇中涉及的众多酶,包括角鲨烯环氧酶(ERG1)、羊毛留醇合成酶、C14-二***化酶、dl4-还原酶、C4-***氧化酶、C4-脱羧酶(ERG26)、3-***还原酶、C24-***转移酶、C8-异构酶、C5-去饱和酶、d22_去饱和酶和d24-还原酶。
[0042]另外,还必须考虑到其他分解代谢酶:LEU2([β]_异丙基苹果酸脱氢酶),环氧角鲨烯环化酶,酵母留醇-24-***转移酶以及麦角留-5,7,24(28)-三烯醇-22-脱氢酶。
[0043]作为从鲨鱼肝脏或从植物类提取方法的第二个替代方法,已经提出了从破囊壶菌目家族(包含破囊壶菌属、Aurantiochytrium属和裂殖壶菌属)、更特别地从Schizochytriummangrovei或SchizochytriumIimacinum的微藻中生产角藍烯的有希望的方法。
[0044]这些微藻在异养条件下(无光;提供葡萄糖作为碳源)产生角鲨烯,并且因此可以由微生物发酵领域的普通技术人员容易地操作。
[0045]因此,这些方法通过可控制的发酵条件提供高质量的角鲨烯,这些角鲨烯的纯化可以很容易地进行以满足食品、化妆品和医学需求。
[0046]然而在破囊壶菌目家族的这些微藻中,角鲨烯是感兴趣的其他脂质化合物(例如二十二碳六烯酸(或DHA)、ω3族的多元不饱和脂肪酸)的副产品,。
[0047]因此似乎角鲨烯被特别描述为商业DHA油类的非皂化部分(连同类胡萝卜素类和甾醇类)的成分之一。
[0048]相比较而言,SchizochytriummangroveiFBI菌株产生DHA的比例为菌体干重的
%,%。
[0049]结论是,天然产生角鲨烯的这些微生物类其产量是非常低的:
[0050]对于ThraustochytridACEM6063,(参见Lewis等人,《海洋生物技术》(.),2001,439-447),
[0051]对于SchizochytriummangroveiFBI,(参见Jiang等人,《农业与食品化学杂志》(.),2004,52,第1196-1200页)。
[0052]为了增加产量,由此显现出优化这些发酵条件至关重要。
[0053]在QianLi等人在《农业与食品化学杂志》(.,2009,57,4267-4272)的文章中描述了角鲨烯是留醇生物合成的一种关键中间体,并且角鲨烯转化成留醇的第一个步骤是由一种氧依赖性角鲨烯环氧酶进行催化。
[0054]因此,反之,如果希望的话,应禁止富含溶解氧的条件从而累积细胞内的角鲨烯。
[0055]因此,在一个低的溶解氧水平(O至5%饱和度)下培养ThraustochytridACEM6063,使得有可能累积超过lmg/g的角鲨烯,然而在一个较高的溶解氧水平(40%至60%)。
[0056]相似地,在15°,然而在20°(参见Lewis等人,《海洋生物技术》(.),2001,3,439-447)。
[0057]《新生物技术》(NewBiotechnology,2010,27-4,382-389页)的文章中,回顾了裂殖壶菌主要通过聚***合酶(首字母缩略词:PKS)途径产生DHA,然而角鲨烯是通过胆固醇生物合成途径合成,这意味着产生这两种化合物时破囊壶菌的营养需求是不同的。
[0058]因此他们工作的目标是系统地研究在生产角鲨烯中不同氮源的效果。
[0059],在包含由谷氨酸钠、酵母提取物和胰蛋白胨组成的氮源混合物的培养基中,裂殖壶菌可以快速生长并且累积“高”量的角鲨烯。[0060]尽管这样,所谓的“高”的角鲨烯产量完全是相对而言的。
[0061]虽然相对于基础培养基的值,%%显著增加角鲨烯的含量和产率,/l的角鲨烯。
[0062]带着优化角鲨烯产量的相同目标,(在《世界微生物生物技术杂志》(.),2010,26-3,1303-1309页中)使用了角S烯单加氧酶(甾醇生物合成中的一种关键酶)的抑制剂:特比萘芬羟基***化物。
[0063]已知角鲨烯含量和产率与微生物培养的年龄相联系。
[0064]细胞培养年龄越长,它累积的角鲨烯越少;实际上,它在留醇生物合成路径中消耗所述角鲨烯越多。
[0065]因此特比萘芬通过防止角鲨烯向甾醇路径的这种消耗而起作用,并且因此使得其有可能刺激角鲨烯在细胞内累积至相对于对照品高达36%至40%。
[0066]但是,在这个研究中从所使用的AurantiochytriummangroveiFB3
菌株获得的最高的角S烯产量,即使比对于酿酒酵母()()所描述的高很多、或者甚至比对于戴尔有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)()所描述的还高,。
[0067]此外,虽然这些代谢途径的转移允许产生相对更高量的角鲨烯,它的风险是通过相应地限制对产生这些相同细胞的类脂膜至关重要的留醇类的产生而弱化这些细胞。
[0068]在这些最高的角鲨烯产量结果中,使用如在由C-《过程生物化学》(ProcessBiochemistry,2009,44,923-927)的文献文章中所报道的微藻,±,其中使用茉莉酸甲酯通过直接作用于角鲨烯合成酶(一种所述代谢途径的关键酶)来调节角鲨烯合成的代谢途径。
[0069]因此,尽管作了所有的努力,这些值远远低于橄榄油的参考值(),并且远非工业规模所需的值。
[0070]考虑到开发比现有技术中描述的那些更有效并且更便宜的一种生产方法,本申请人:公司已经发展了自己在破囊壶菌目物种家族的微藻的发酵条件优化上的研究。
[0071]因此本发明涉及一种用于获得对于100g的干生物质而言Ig角鲨烯规模的方法,也就是,超过这个领域的文献中通常所描述的量高达