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专利名称:人黑色素皮质激素受体4的制备方法
技术领域:
本发明涉及人黑色素皮质激素受体4的制备方法。
背景技术:
黑色素皮质激素受体4(Melanocortin4Rec印tor,MC4R),是第一个发现的与人类显性遗传疾病肥胖症相关的靶位点,它可以与瘦素(L印tin)、神经肽Y(Neurop印tideY,NPY)以及a-黑素细胞刺激
(Alpha-melanocyte-sti咖latinghormone,a-MSH)—起调节体重禾口摄食量。对于MC4R基因突变在调节人类体重变化中重要性的研究始于1998年。到目前为止,已有10余个MC4R突变位点被相继报道(MC4R及其基因突变与肥胖相关性研究进展,张翼飞综述,国外医学遗传学分册2003年第26巻第1期)。虽然MC4R是中枢神经系统中参与调节肥胖症发生的重要因素,但是由于MC4R是跨膜G蛋白耦联受体超家族的成员之一,它的表达和纯化非常困难,所以目前关于肥胖症的药物设计研发主要集中在MC4R的选择性激动剂和抑制剂的药物研发领域。国内外有许多相关的文献和专利报道了该领域最新的进展(黑皮质素受体4激动剂研究进展,孙彭利等;HolderJR,Haskell—:30yearsofstructure—activityrelationship(SAR)studies[J].MedResRev
,2004,24(3):325-356)。因此,本领域迫切需要一种体外高效表达和纯化人MC4R蛋白的方法,以便能够大量生产供科学研究和药物设计所用的MC4R蛋白,以便用于核磁共振实验来了解MC4R蛋白的结构,或进行药理学实验,促进人们对该受体结构的了解,促进人们对MC4R的特异性配体与受体相互作用的理解,为药物设计提供新的线索和思路。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备人黑色素皮质激素受体4蛋白的方法。
本发明所提供的制备人黑色素皮质激素受体4蛋白的方法,包括如下步骤将
人黑色素皮质激素受体4蛋白的编码基因插入pET系列载体的多克隆位点,得到含有所述编码基因的重组表达载体,再将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21中,得到含有所述编码基因的重组菌,培养所述重组菌,得到人黑色素皮质激素受体4蛋白。
4所述培养包括如下步骤将所述重组菌先在37"C条件下培养至菌液的OD,,再在12"C条件下培养至菌液的0De。。,然后用异丙基-P硫代半乳糖苷进行诱导培养。
所述培养在振荡条件下进行,所述振荡的转速为225转/分钟,旋转半径为
26min;所述诱导培养的时间为48-60小时。
所述重组表达载体是通过将所述编码基因插入载体pET21b的多克隆位点得到的;所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
;;;;;;;氨苄青霉素50mg/L,其余为水。
本发明方法还包括如下步骤取上述诱导培养后得到的培养液,将所述培养液中的细胞破碎,弃沉淀取上清液,再进行亲和层析过滤,收集洗脱峰,得到人黑色
素皮质激素受体4蛋白;所述亲和层析过滤的方法包括如下步骤依次用洗涤缓冲
液l、洗涤缓冲液2和洗脱缓冲液进行洗脱,收集所述洗脱缓冲液洗脱下来的洗脱峰;
%AZ316,20mMTris,200raMNaCl,,其余为水;;
%AZ316,30mM咪唑,20mMTris,200mMNaCl,-巯基乙醇,其余为水;;
%AZ316,250mM咪唑,20mMTris,200mMNaCl
,-巯基乙醇,其余为水;;
所述百分含量均为质量百分含量。
在细胞破碎前,向所述培养液中加入细胞破碎液和P-巯基乙醇;所述细胞破碎液由70mMTris和300mMNaCl组成,余量为水;。
细胞破碎的方法为超声波破碎;所述超声波破碎的方法为超声强度为30W,超声环境为O'C,总超声时间为8分钟,超声工作方式为每超声作用5秒钟间隔7秒钟。
在所述超声破碎后、弃沉淀之前还包括如下步骤向所述培养液中加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶,混匀。
在所述加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶后、弃沉淀之前还包括如下步骤向所述
5培养液中加入AZ316和P-巯基乙醇,混匀。
本发明所提供的制备人黑色素皮质激素受体4蛋白的方法,具有表达量高、蛋白能表达并折叠在细胞膜上的优点,实验证明,;而且本发明方法具有操作简单、成本低廉的特点。因此,本发明方法适合于工业生产中应用。
图1为MC4R蛋白洗脱图谱。
图2为纯化的MC4R蛋白的电泳图。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
AZ316(中文名称是正十六垸基-N,N-二***-3-铵-1-丙垸磺酸盐),购自Anatrace公司,产品目录号为AZ316,AZ316不是物质的名称)
本发明方法包括如下步骤将人黑色素皮质激素受体4蛋白的编码基因插入pET系列载体的多克隆位点,得到含有所述编码基因的重组表达载体,再将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21中,得到含有所述编码基因的重组菌,培养所述重组菌,得到人黑色素皮质激素受体4蛋白。
其中,所述培养按照如下方法进行将所述重组菌先在37。C条件下培养至菌液的0D6。。,再在12。C条件下培养至菌液的OD6。。,然后用异丙基-P-D-硫代半乳糖苷进行诱导培养。
在所述培养过程中还可以进行振荡,振荡的转速为225转/分钟,旋转半径为26ram;诱导培养的时间为48-60小时。
所述重组表达载体是通过将所述编码基因插入载体pET21b的多克隆位点得到的;所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
;;;;;;;氨苄青霉素50mg/L
,其余为水。
本发明方法还包括如下纯化步骤取上述述诱导培养后得到的培养液,将所述培养液中的细胞破碎,弃沉淀取上清液,再进行亲和层析过滤,收集洗脱峰,得到人黑色素皮质激素受体4蛋白;所述亲和层析过滤的方法包括如下步骤依次用洗涤缓冲液l、洗涤缓冲液2和洗脱缓冲液进行洗脱,收集所述洗脱缓冲液洗脱下来的洗脱峰;
%AZ316,20raMTris,200mMNaCl,-巯基乙醇,其余为水;;
%AZ316,30mM咪唑,20mMTris,200roMNaCl,,其余为水;;
%AZ316,200mM咪唑,20mMTris,200mMNaCl,-巯基乙醇,其余为水;;
所述百分含量均为质量百分含量。
在进行细胞破碎前,向所述培养液中加入细胞破碎液和P-巯基乙醇;所述细胞破碎液由70函Tris和300mMNaCl组成,余量为水;。其中,细胞破碎液与所述培养液中菌的配比为20ml细胞破碎液/g湿菌;P--
巯基乙醇/g湿菌。
细胞破碎的方法为超声波破碎;所述超声波破碎的方法为超声强度为30W,超声环境为O'C,总超声时间为8分钟,超声工作方式为每超声作用5秒钟间隔7秒钟。
在细胞破碎后、弃沉淀之前向所述培养液中加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶,混匀,使其作用l小时。其中,溶菌酶与菌的配比为400-480U/g湿菌,DNA酶与菌的配比为500-600U/g湿菌,RNA酶与菌的配比为24-28U/g湿菌。
在加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶后、弃沉淀之前,再向所述培养液中加入AZ316和e-巯基乙醇,混匀,使其作用l小时。其中,;6--巯基乙醇/g湿菌。
下面以具体的实施例进一步详细阐述本发明方法。
实施例l、人黑色素皮质激素受体4蛋白(人MC4R蛋白)的表达、纯化一、人MC4R蛋白的表达1、人MC4R蛋白编码基因的扩增设计扩增人MC4R蛋白编码基因的引物序列,如下
引物1:5,-ACCTGCATATGGTGAACTCCACCCACCG-3,(横线部分为限制性内切酶NdeI的识别序列)
引物2:5'-TACGTACTCGAGATATCTGCTAGACAAGTCACAAAG-3,(横线部分为限制性内切酶XhoI的识别序列)PCR扩增以从Novagen公司购得的质粒为模板,质粒的名称是pET-21a-d(+),在引物1和引物2的引导下,进行PCR扩增。上述扩增条件为先
95。C2分钟;再95°C30秒,57°C30秒,72°C1分10秒,共30个循环;最后72°CIO分钟。
2、表达载体的构建
将步骤l获得的PCR产物用限制性内切酶Ndel和Xhol进行酶切,回收目的片段,将目的片段与经与用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后的pET21b载体连接,得到重组表达载体pET21b-MC4R。
取所获得的连接产物1微升,加入100微升大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,轻轻混匀后冰浴2O分钟;再在42。C水浴中静置90秒,热休克后立即放置在冰上;2分钟后加入室温的LB培养基1毫升,在37t、转速为200转/分钟的摇床上水平震荡30分钟;取100微升转化物涂于含50微克/毫升氨节青霉素的LB琼脂培养板上,37i:培养16小时;挑选阳性克隆,提取质粒,进行测序鉴定,测得重组质粒中插入的外源基因的序列如序列表中序列l所示,与人MC4R的DNA序列(人MC4RDNA序列的Genebank号是丽一005912)比较,结果完全一致。
3、人MC4R蛋白的表达
按照步骤2中所述方法制备和筛选含有重组表达载体pET21b-MC4R的阳性重组菌,将重组菌置于装有M9培养基的摇瓶中,在37t:、转速为225转/分钟的摇床上水平震荡培养至其OD,;将摇瓶转移至12t:摇床中,同样在转速为
225转/分钟(旋转半径为26mm)的条件下水平震荡培养至其OD,,(),培养48-60小时,得到发酵培养液。其中,培养基M9的组成为Na2HP04[142Da];KH2P04[136Da];NaCl[];;NH4C1[];CaCl2[111Da];MgS04[120Da];氨节青霉素50mg/L;余量为水。
离心收集菌体,悬浮于细胞破碎液(细胞破碎液的组成为70mMTris,300mMNaCl,其余为水;),冻存于-80°C。二、人MC4R蛋白的纯化
在4。C下,取15毫升步骤一中3所得到的菌液(约1克湿重细菌),-巯基乙醇中,然后进行超声波破碎(超声强度30W;超声环境为冰水混合物;总超声时间为8分钟,每超声5秒钟,间隔7秒钟);超
8声破碎后,向其中加入溶菌酶溶液(lmg/L)、DNA酶溶液(50iig/L)和RNA酶溶液(20yg/L)(溶菌酶与菌的配比为440U/g湿菌,DM酶与菌的配比为550U/g湿菌,RNA酶与菌的配比为26U/g湿菌),混匀l小时;再向其中加入4ml5。/c)(质量百分含量)的AZ316()-巯基乙醇(P-巯基乙醇与菌的配比是
-巯基乙醇/g湿菌),混匀l小时;然后在4'C条件下以大约27,000g的速度离心15分钟后,弃去沉淀物,取上清。
将上述得到的所有上清液进行镍柱亲和层析纯化,方法如下将上清液上样于lml镍柱(Qiagen公司产品),然后依次用25个柱体积的洗涤缓冲液1、10个柱体积的洗涤缓冲液2、5个柱体积的蛋白洗脱缓冲液进行洗脱,蛋白洗脱缓冲液的流速为1ml/分钟,收集用蛋白洗脱缓冲液洗脱下来的洗脱峰即是纯化产物。亲和层析的洗脱图谱如图l所示。
%(质量百分含量)AZ316,20mMTris,200mMNaCl,L4raMP-巯基乙醇,其余为水,;
%(质量百分含量)AZ316,30函咪唑,20mMTris,200raMNaCl,,其余为水,;
%(质量百分含量)AZ316、250mM咪唑,20raMTris,200mMNaCl,-巯基乙醇,其余为水,。
,向其中加入20微升2XSDS上样缓冲液混匀,取15微升进行SDS-PAGE电泳。
上述表达和纯化的步骤中同时以空载体pET21b作为对照。