人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测的制作方法.docx

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专利名称:人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测的制作方法
技术领域:
本发明涉及一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测,属于动物模型和动物细胞系的技术领域。
背景技术:
肿瘤的侵袭与转移时恶性肿瘤最基本的生物学特性之一,原发性肿瘤致死是较为罕见的,90%以上肿瘤患者的死于肿瘤细胞在人体内的转移时。人黑色素瘤是危害头颈部的主要疾病之一,成为最常见的恶性肿瘤。然而目前肿瘤转移的确切机制尚不十分清楚,关于肿瘤转移一直是肿瘤学研究的热点。所以在本领域的研究中较大的局限性,制约了对人黑色素瘤转移机制的研究的进展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种人黑色素瘤高转移模型、细胞亚系以及建立方法和转移的动态检测,以解决现有技术所存在的诸多不足之处。用肺转移灶(人恶性黑色素瘤细胞株A375小鼠肺转移)在SCID小鼠用体内筛选的方法建立了皮下移植小鼠高转移模型及相应的细胞株,而且存在血路和淋巴两个转移途
径;提出用深度免疫缺陷动物进行高转移模型的体内筛选,而在裸小鼠体内表达和应用的实验思路,并获得证实。Alu顺序具有种属特异性,是人类基因组共有的序列且只为灵长类所特有。人Alu顺序探针只能用于检测人基因组中的Alu序列。利用PCR方法可以在脏器中检测常规病理学检查无法发现的微转移的肿瘤细胞。我们用BNX小鼠进行人黑色素瘤皮下移植,并检测了相关脏器的Alu基因表达,由于移植的瘤组织块完全来源于人黑色素瘤所以保证了实验的可靠性、特异性和灵敏性。应用PCR方法检测Alu基因方法简单、灵敏度高、特异性强,可用于人体肿瘤动物异种移植模型中检测脏器转移特别是微转移,是一种值得推广的方法,有必要深入探讨。本发明所需要解决的技术问题,可以通过以下技术方案来实现一种人黑色素瘤高转移模型,其特征在于,用人恶性黑色素瘤细胞株A375(2000年9月从中国科学院上海生命科学院细胞库获取,细胞编号TCHu4,由上海市肿瘤研究所按常规方法长期保存和传代)进行SCID小鼠皮下移植,取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增。一种人黑色素瘤高转移模型的建立方法,包括以下步骤。(1)利用人恶性黑色素瘤细胞株A375进行SCID小鼠皮下移植,取肺转移灶移植至SCID小鼠皮下扩增;(2)SCID小鼠体内综合筛选;选取深度免疫缺陷的SCID小鼠进行肿瘤高转移的体内筛选,等肿瘤长至直径
l_2cm大小时,进行皮下移植传代,待动物出现明显恶性病质时,取肺可疑灶重复上述过程;第四代起按转移肿瘤组织一皮下移植一肺转移的体内筛选方式直接传代。(3)进行试验检测,验证细胞特征。其中步骤(2)所述皮下转移方法是将肿瘤组织切成2mm3大小,用穿刺针移植至SCID小鼠右侧腋窝皮下,每次筛选传代5-20只SCID小鼠不等,雌雄兼用,5-8周龄,饲养和实验严格按照SPF要求。其中步骤(潜伏期从筛选初期的7-14天逐渐缩短至5天左右,荷瘤寿命从60-75天下降并稳定在45天左右。其中步骤⑵皮下100%成瘤;%(1/6),60%(3/5)、50%(4/8),70%(14/20)^%(16/18),从第6代起肺转移率保持在100%;体表淋巴结转移第5代观察SCID小鼠皮下移植的同测腋窝淋巴结转移,用该动物的肺转移灶继续体内筛选,第6代至20代的186只动物中的147只发生淋巴结转移(%),筛选第18Rkid小鼠,腋窝淋巴结肿大,。其中步骤(3)中所述试验包括病理组织学检查、免疫组织化观察、流式细胞分析。所述病理组织学检查,光镜下筛选的皮下移植瘤巢团状弥散分布。肺脏的肿瘤细胞弥散状及腺样排列,充斥在肺脏边缘,肺泡间隔及支气管周围,细胞排列的形态、大小及分布各不相同,细胞分化差、核大、分裂相多见。每代均能见到肺血管内有散在或成团的肿瘤细胞。所述免疫组织化观察筛选的肿瘤组织免疫组化结果
TGF-betal(转换生长因子-betal)阳性,Intergrinbeta5阴性,CD31阳性,nm23(nm蛋白)阴性。所述流式细胞分析:G2-M+S期(增殖期)%%,%%,体内筛选后的人黑色素瘤模型和非转移模型相比,肿瘤细胞生长旺盛,调亡减少。一种人黑色素瘤高转移细胞亚系,其特征在于,所述人黑色素瘤高转移细胞亚系为A375sci,是人类肿瘤细胞核型,染色体为近端着丝,呈异倍体核型,以亚三倍体为主,染色体范围为60-75条。人黑色素瘤高转移细胞亚系A375sci,包藏于中国典型培养物保藏中心。保藏地址中国湖北省武汉市武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山,邮编430072。保藏日期2009年7月29日,保藏编号CCTCCNO:C200954。所述源细胞是人恶性黑色素瘤细胞株A375(简称为人黑色素瘤细胞A375,或A375)。所述裸小鼠肺转移率是90%以上、BNX小鼠肺转移率是100%并伴有转移率80%以上的淋巴结转移。一种人黑色素瘤高转移细胞亚系的建立方法,其特征在于,包括以下步骤(1)人黑色素瘤高转移细胞系的建立与传代将荷瘤小鼠颈椎脱臼法处死,无菌条件下取出皮下移植瘤A375,剔除坏死组织、纤维包膜及血管,用含双抗的PBS洗2次,向组织滴1-2滴含10%胎牛血清的DMEM培养液,用显微剪刀和显微镊将其尽量剪成小块,用显微镊将剪切好的组织块放在
6cm培养皿并在皿底均勻放置,。沿皿壁缓缓加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,然后盖好皿盖,将培养皿放置在37°C、含5%CO2的培养箱内静置培养,以后所建立的原代细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行常规培养和传代,命名为A375sci。(2)细胞形态学观察和生长曲线测定单细胞悬液加入M孔板培养,每孔含4XIO4个细胞。次日消化计数3孔细胞,连续计数7天,绘制生长曲线,按下列公式计算细胞倍增时间TD=Tlg2/lg(N/N0)(TD倍增时间,T时间间隔;Ntl起点细胞数,N终点细胞数)。未经筛选的A375以同样方法进行测定作为对照;(3)进行试验检测,验证细胞特征。进行统计。所述试验包括流式细胞术分析、细胞侵袭基底膜实验、细胞染色体分析、体内致瘤实验和PCR检测。所述流式细胞术分析体内筛选后的瘤组织取出后,加含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养。第5天部分细胞开始贴壁,小组织块周围有少许细胞向外游出,第10天细胞已经牢固贴壁,更换培养液。此后,根据细胞生长情况传代,随着传代次数的增加成纤维细胞可完全去除;此后每3至4天传代一次,中间更换培养液一次,细胞生长良好;目前已传至10代以上。所述A375sci与A375—样,半贴壁生长,贴壁程度低于后者;形态以圆形或梭形为主,大小较一致,略小于A375细胞;喜好聚集生长,尤其是上层培液中的悬浮生长的细胞,常常成簇或成团。所述细胞染色体分析
:A37^ci为人类肿瘤细胞核型,染色体为近端着丝,呈异倍体核型,以亚三倍体为主。染色体范围为60-75条。,,濒死前处死小鼠,观察各脏器转移情况;将皮下肿瘤接种到11只裸小鼠体侧近腋部皮下,平行向下传代,观察转移情况;BNX小鼠和裸小鼠均表现出很好的转移;将肺转移灶移植到裸小鼠腋侧皮下,看到淋巴结广泛转移;肺脏表面粗糙充血,见灰血色小结节成片或弥散分布。PCR检测通过Alu-PCR检测,被检测小鼠肺部转移灶及淋巴结均呈阳性,BNX小鼠皮下接种A375sci后形成的肺转移灶,裸小鼠淋巴结转移及肺转移。—种人黑色素瘤高转移细胞亚系转移的动态检测,其特征在于,包括以下步骤(l)A375sci黑色素瘤BNX皮下移植模型的建立待肿瘤长到合适大小,颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠,75%酒精消毒皮肤,剥取出移植瘤,置于加抗生理盐水中漂洗,剔除纤维包膜及出血坏死部分,切取生长良好的瘤组织,;抓取动物,固定,消毒皮肤,用20号套管针将剪切好的瘤组织块移植小鼠右侧背部近腋部皮下。按此法皮下移植BNX小鼠34只;(2)肺组织取材从移植的第二天起算,在21、31、41、51,批量处死8只动物,第五周为10只动物。脱颈椎处死小鼠,编号,称重量取廇径;消毒水洗净,剖检;观察肿瘤转移情况,肉眼及压片对
肺的转移情况进行判定与记录;取转移灶或疑似转移灶用于Alu-PCR,以及中性甲醛固定,留作病理;多余肺组织锡纸包好,保存于超低温冰箱;
(3)Alu—PCR
(4)琼脂糖凝胶电泳
取5u1PCR反应液与lul6XLoadingBuffer混合,%琼脂糖凝胶电泳,所述琼脂糖凝胶含终浓度为lug/mlEtBr,在点样孔内点样,l10V,30min;
(5)凝胶成像显影
在凝胶图像处理系统中观察结果。
其中步骤(3)所述Alu—PCR包括
1)DNA的提取;
2)DNA浓度的测定;
3)Alu—PCR,扩增条件95℃,5min;95℃,30s;60℃,20s;72℃,20s;72℃,.。
所述Alu—PCR的引物序列
Alu—wlSequence(5’to3’)Gcc/g/AA/CCCAgeAC///g;
Alu—w2Sequence(5’to3’)ACgCCA//C/CC/gCC/CA。
所述Alu—PCR的基本反应体系
ComponentV。lum(20u1)Concentration

lO*×

dNTP,


/

所述Alu—PCR的结果第五周,A375sci移植到BNX皮下,4w后剖检8只小鼠,PCR检测肺转移阳性率为100%。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。
图lA为SCID小鼠淋巴结转移。
图lB为SCID小鼠肺转移。
图lC为裸小鼠肺转移。
图2A裸小鼠淋巴结转移。
图2B裸小鼠淋巴结转移。
图3皮下瘤(HEX100)。
图4肺转移(HEX100)。
图5肺小血管内有大量肿瘤细胞(HEXi000)。
图6淋巴结转移(HEX100)。
图7筛选的皮下移植瘤电镜观察。
图8A为筛选的皮下移植瘤IHC结果,TGF-betal(转换生长因子-betal)阳性。图8B为筛选的皮下移植瘤IHC结果,Intergrinbeta5阴性。图8C为筛选的皮下移植瘤IHC结果,⑶31阳性。图8D为筛选的皮下移植瘤IHC结果,nm23(nm蛋白)阴性。图9A为人黑色素瘤A375细胞形态学观察(光镜X200)。图9B为人黑色素瘤A37kci细胞形态学观察(光镜X200)。图10A375细胞与A37kci细胞生长曲线。图IlA为A375细胞侵袭基底膜实验。图IlB为A37kci细胞侵袭基底膜实验。图12A37kci皮下移植105d肺转移的PCR检测。图13BNX小鼠皮下接种A37kci后形成的肺转移灶。图14A为A37kci裸小鼠淋巴结转移。图14B为A37kci裸小鼠肺转移。图15PCR检测BNX小鼠肺微转移Qw)结果。图16A为PCR检测BNX小鼠肺微转移(3w)结果。图16B为PCR检测BNX小鼠肺微转移(3w)结果。
图17为PCR检测BNX小鼠肺微转移()结果。图18为PCR检测BNX小鼠肺微转移(5w)结果。人黑色素瘤高转移细胞亚系A375sci。保藏日期2009年7月29日。保藏单位中国典型培养物保藏中心,简称CCTCC。保藏编号CCTCCNO:C200卯4。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体图示,进一步阐述本发明。一、人黑色素瘤SCID小鼠皮下移植高转移模型的体内筛选
(T、B细胞功能缺陷),由上海市肿瘤研究所提供[生产许可证号为SCXK(沪)2007-0001]。鼠龄68周,体重1822g,雌雄兼用,试验及饲养严格遵守SPF级标准要求[使用许可证号为SYXK(沪)2007-0001]。,由上海市肿瘤研究所按常规方法长期保存和传代(2000年9月从中国科学院上海生命科学院细胞库获取,细胞编号TCHu4。,庆大霉素,1%戊巴比妥钠,10%中性甲醛溶液,%戊二醛,内源性过氧化物酶,1%锇酸固定液,3%醋酸铀-枸橼酸铅,链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶,DAB,苏木素,胎牛血清,DMEM,胰蛋白酶,PBS等均为进口分装或国产分析纯试剂。;CJ-2F型医用净化工作台由苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产;双人超净工作台由苏州净化设备有限公司生产,型号为SW-CJ-2FD;恒温水浴锅为上海精宏实验设备有限公司产品,型
10号为DK-S22;数码相机为NIKON产品;超低温冰箱(Jouan,France);液氮生物容器(MVECRY0SYTEM4000);眼科剪;眼科镊;培养皿;20号套管针;电热真空灭菌器等为国产。,发现其中一批动物中(共6只)有一只明显肺转移,取肺转移灶移植至