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第二十四卷第六期
WKY
基于代谢组学探讨电针对抑郁大鼠的
抗抑郁作用*
112113
李翔,曾晓铃,顾政平,李珊珊,徐世芬**,李蔚**
(上海中医药大学附属市中医医院上海;上海交通大学医学院学术部上海;
复旦大学基础医学院上海)
24
摘要:目的采用液质联用非靶向代谢组学技术探究电针抗抑郁的作用机制方法将只雄性
WKYWistar8
大鼠随机分为模型组、电针组、假针组,每组8只。雄性大鼠只设为对照组。电针组于“百会”
20min153
“足三里”进行电针治疗,每次,周次,连续治疗周。假针组取穴同电针组,毫针不刺破皮肤,毫针
与电针仪导线相连,但无电流通过。最后通过旷场实验、强迫游泳和新奇抑制摄食实验评价行为学改变;对
-
照组、模型组和电针组大鼠粪便采用高效液相色谱质谱系统分析代谢物及组成的变化,探究抑郁症核心生
物标记物的代谢途径差异,以评价电针的抗抑郁作用机制。结果与对照组相比,模型组在旷场试验中的
<<<
直立次数减少(P),中央运动距离减少(P);强迫游泳的不动时间延长(P);新奇抑制摄食
<<
潜伏摄食时间增加(P)。与假针组相比,电针组在旷场试验中的直立次数增加(P),中央运动
<<<
距离增加(P);强迫游泳的不动时间减少(P);新奇抑制摄食潜在摄食时间减少(P)。通过
WKY
模式识别分析发现,大鼠代谢产物发生显著差异,电针后的代谢产物也出现明显差异。对显著性差异
10--H4-
代谢产物分析发现,甜菜苷在模型组中升高,在电针组中降低;环己基氨基磺酸酯、氢过氧神经前
15S-KEGG
列腺素、()羟基二十碳三烯酸、地奥司明在模型组中降低,在电针组中升高。通路结果发现显著
差异代谢产物主要参与了脂质代谢、氨基酸代谢、生物素降解与代谢等代谢途径。结论电针能改变抑郁
大鼠的抑郁样行为,可能是通过调节脂质代谢、氨基酸代谢、生物素降解与代谢等代谢途径发挥抗抑郁的治
疗作用。
WKY
关键词:抑郁症代谢组学电针代谢通路抑郁大鼠
doi:::A
中图分类号文献标识码
Depression
抑郁症()是一种多因素导致的精神障变[5],免疫功能异常[6]及神经可塑性[7]等。然而现有的
碍,主要特征是情绪忧郁、缺乏兴趣和动力[1]。世界卫治疗抑郁症的药物不能有效的改善抑郁症状,针灸作
生组织认为抑郁症是社会中负担最重的疾病,它可能为一种安全绿色的治疗方法,已经被证实能够有效的
成为全球高致残率的主要诱因之一[2-3],在我国抑郁症改善抑郁患者的症状[8-9]。因此,进一步了解针灸治疗
患病率在逐年上升,但有将近一半以上的患者未接受抑郁症的作用机制可以为抑郁症的预方和治疗提供
任何治疗。目前对于抑郁症的机制研究主要集中在新的思路与方向。
--HPA
神经递质的减少[4],下丘脑垂体肾上腺()轴改随着对抑郁症的研究深入,通过蛋白组学、基因
2021-10-06
收稿日期:
2022-05-22
修回日期:
81973943/TpH5-HT-
*国家自然科学基金委员会面上项目():针刺通过调节拟杆菌介导宿主合成干预抑郁大鼠的肠脑双向调节机制,负责
2019LJ06p11mGluR5
人:徐世芬;上海市卫健委医学领军人才项目():基于介导膜定位探究电针对抑郁小鼠行为的作用机制,负责人:徐世
芬。
**通讯作者:李蔚,医学博士,主要研究方向:针灸治疗抑郁症的机制研究;徐世芬,主任医师,主要研究方向:针刺治疗脑病的临床与机制研究。
2186〔ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica-WorldScienceandTechnology〕
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世界科学技术中医药现代化专题讨论一:针灸的作用效应临床与机制研究
组学和代谢组学等组学方式揭示抑郁症的发病机制验动物准则和使用规范》及动物伦理实验要求开
被广泛接受。代谢组学是通过分析比较机体内代谢展的。
[10]
物在不同病理生理状态下的变化,代表着生物体对动物分组及代谢样本收集
24WKY
内部和外部刺激的最终反应。目前,代谢组学广泛用只大鼠随机分为模型组、电针组和假针
[11]8Wistar
于电针治疗各种疾病的研究中,路思宇等人利用代组,只大鼠作为对照组。电针组:抑郁模型大
谢组学研究电针对脑梗死大鼠的尿液代谢的影响,陈鼠进行电针干预。取穴:百会、足三里,参照《实验动
[12]5mm
平等运用代谢组学研究电针对类风湿关节炎动物模物针灸穴位图谱》。操作方法:百会向前斜刺,足
[13]3mm
型内源代谢物的影响,新昕等人通过血清代谢组学三里直刺,华佗电针仪,将正极连接于百会上,负
研究电针对消化不良大鼠模型的影响,因此,代谢组极连接足三里,足三里单侧交替进行连接,连续波,频
2Hz
学特别有利于识别病理生理影响的过程,为疾病的发率,电流根据大鼠头部出现颤动并且不嘶叫为
15min3
生提供重要的证据,能够寻找出对疾病起着决定作用度,留针,连续治疗周。为避免因动物捆绑而
的生物标志物。引起的应激反应而干扰实验结果,大鼠在电针过程中
目前的研究已经表明,抑郁症的发生和代谢产物
被置于特制的塑料鼠笼中,使得大鼠有一定的活动空
的变化有关[14-16]。针刺是在整体观念的指导下对机体
间。假电针组:抑郁模型大鼠进行假电针干预。采用
产生一系列的反应从而达到治疗的效果。但是否能
同电针组同样的抓取,将同样的针灸针分别用胶带固
够通过调节代谢产物,影响相关代谢通路起到改善抑
定于百会、足三里体表,并给予电极连接,但无电流,
郁行为需要进一步研究。基于此,本研究将在证实电
WKY干预时间同电针组。电针干预结束收集对照组、模型
针能够改善抑郁大鼠抑郁样行为的基础上,进
组和电针组大鼠的粪便样品,假针刺组不收集。
一步采用代谢组学的研究方法,
行为学测试
起代谢产物变化,影响相关代谢通路,从代谢组学的
方向评估针刺的抗抑郁作用。50cm×50cm×40cm
旷场场地为一个的正方形区
1材料与方法域。每次实验将一只实验大鼠置于旷场中,通过旷场
5min
。在进行
仪器与试剂75%
NewClassicMSMETTLERTOLEDO下一只实验前,用酒精擦拭旷场,待旷场充分干
电子天平();9
Eppendorf-10L燥后放入大鼠。旷场底部被平分为个区域,其中心
冷冻离心机();控温超声波清洗机(宁
为中央区域。大鼠在中央区的运动路程总和为中央
波新芝生物科技股份有限公司);多样品冷冻研磨仪
距离,在旷场内前肢离地,后肢着地为直立状态并记
(上海万柏生物科技有限公司);台式快速离心浓缩干
录次数。旷场中的运动总路程为总距离将用来评估
燥器(太仓市华美生化仪器厂);氮气吹扫仪(上海净
ABSCIEX
信实业发展有限公司);液相色谱系统();质大鼠的运动能力。旷场实验数据采集系统使用上海
ABSCIEX
谱仪();华佗电针治疗仪(苏州医疗用品有欣软平台进行记录与分析。
限公司);针灸针(无锡佳健医疗器械股份有限公司),45cm18cm24℃-
行为学示踪系统(上海欣软科技有限公司)。往高、直径的玻璃圆筒中倒入
℃30cm
动物的水,水深度。将大鼠置于圆筒中,通过软
SPFWistarWistar-KyotoWKY5min
级雄性大鼠和()雄件计时,记录内大鼠的不动时间。
6
性大鼠,周龄左右,
50cm40cm
术有限公司。所有动物进入动物房后均需经过一周实验场地为长、高的正方形敞箱,在
的适应,期间自由摄食和饮水,然后再开始进行试验。箱底中央固定一食盒,在盒中放入数块糖丸。试验开
22℃-27℃40%-60%48h
动物房室温维持在,湿度为,噪音始前,动物禁食,试验时从任意位置将大鼠入敞箱
50dB5min
控制在以下,每天接受昼夜节律的光照。本次中,通过摄像采集系统观察,记录大鼠的活动量
实验中的所有动物实验均是按照《上海中医药大学实和放入大鼠到大鼠前肢抱起糖丸进食的潜伏时长。
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第二十四卷第六期
代谢数据采集与处理分析。数据分析操作主要在美吉生信云平台上完成。
-80℃
样本制备:从冰箱中取出粪便样品,使用电统计分析
子天平精确称取粪便样品然后移至的离动物行为学检测数据采用统
6mmMean±SD
心管中,加入直径的研磨珠研磨,往离心管内加计软件进行分析,实验数据采用表示,符合
·mLL-2-400µμL
入含-1***苯丙氨酸的提取液,正态分布及方差齐性,多组间比较采用单因素方差分
6min4℃40<
将样品置于冷冻组织研磨仪研磨,在,析,不符合正态分布则采用非参数检验。P表示
KHz30min-
的低温超声中提取,将上述结束的样品于差异有统计学意义。
20℃30min4℃13000g
的条件静置,然后在,的离心机
15min2结果
中离心,取上清液待上机分析,另外每个样本各
20µ
取的上清液,混合均匀后作为质控样本。行为学检测结果
LC-MSACQUITYUPLC
分析液相条件:
HSST3100mm×,µμm;Waters,Milford,
(与对照组相比,模型组在旷场试验中的直立次数
USAA95%+5%%<<
);流动相:水乙***(含甲酸),流更少(P),中央运动距离减少(P);与假针
%+%+5%%<
动相:乙***异丙醇水(含甲组相比,电针组在旷场试验中的直立次数增加(P
·min10µ<
酸);流速为-1,进样量为,柱温为),中央运动距离增加(P),差异有统计学意
40℃
。义。四组在旷场试验中的总运动距离没有统计学差
质谱条件:采用正、负离子模式采集质谱信号,检异,但是相较于对照组,模型组的总运动距离降低,相
5000V1
测参数:正、负离子模式下离子源电压分别为较于假针组,电针组总运动距离增加,结果如图
4000V3050
和,气帘气、喷雾气和辅助加热气分别为、所示。
psi50psim/z50-1000
和,质量扫描范围,去簇电压:
80V550℃
,离子源温度为。在强迫游泳中,与对照组相比,模型组大鼠不动
LC-MS<
代谢数据处理:将采集所得的数据原始文时间延长(P),与假针组相比,电针组在强迫游
ProgenesisQIWatersCorporationMilford,USA<
件导入(,)泳的不动时间缩短(P),结果如图所示。
进行数据处理,最终得到含保留时间、
,
度等信息的数据矩阵。将所得的数据进行归一化处在新奇抑制摄食试验中与对照组相比,模型组的
<
理后可用于筛选差异表达的代谢物。将筛选出的差潜伏摄食时间增加(P)。与假针组相比,电针
<
异代谢物和数据库进行注释比对,可以获得对应的代组的潜在摄食时间减少(P)。结果如图所示。
MetaboAnalyst
谢通路的代谢物集,通过(大鼠代谢物质变化
)
线数据库对差异代谢物所涉及的相关代谢通路进行对电针组、模型组及对照组大鼠的粪便进行了质
ABC
25000251500
2000020
1000
1500015####
1000010
直立次数(n)
总距离(mm)500
***中央距离(mm)
50005*
000
对照组模型组电针组假针组对照组模型组电针组假针组对照组模型组电针组假针组
图1旷场实验的总距离(A)、直立次数(B)和中央距离(C)
△△△△
注:与对照组比较,*P<,***P<;与模型组比较,#P<,###P<;与假针组比较,P<,P<。
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世界科学技术中医药现代化专题讨论一:针灸的作用效应临床与机制研究
AB
150200
***
***150
100###
100
不动时间(s)50潜伏时长(s)
###50
00
对照组模型组电针组假针组对照组模型组电针组假针组
图2强迫游泳(A)和新奇抑制摄食(B)
△△△△△
注:与对照组比较,***P<;与模型组比较,###P<;与假针组比较,P<,P<。
AScores(PCA)BScores(PCA)
7050对照组
6040模型组
电针组
5030
20
40
10
300
20-10
10-20
(%)
(%)
0-30
PC2
PC2-40
-10
-50
-20
-60
-30对照组-70
模型组
-40电针组-80
-60-40-20020406080100-60-40-20020406080100
PC1(%)PC1(%)
图3PCA分析:正离子模式(A)和负离子模式(B)
AB
Score(PLS-DA)plotScore(PLS-DA)plot
25对照组20对照组
20模型组15模型组
电针组电针组
151%)
01%)10
105
2(6.
2(
0
5
5-
-10
10-
-15
15Component
Component-
-2020
--
151050510152025302015105051015202530
---Component1(%)---Componen-t1(%)
图4PLS-DA分析:正离子(A)和负离子(B)
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第二十四卷第六期
PCAPLS-DA
谱检测,然后采用(主成分分析)和(偏最食潜伏时长反映大鼠对食物的欣快感;旷场实验行为
小二乘判别分析)统计方法对结果进行识别分析。采则通常用于评估大鼠在新异环境中的自主和探究行
PCA3
用方法对所有样本的数据进行分析,结果见图。为。上述行为学检测都能作为评估抑郁模型成功与
PC2
在正离子和负离子模式下,对照组和模型组均沿否的标准。我们的实验结果表明,相较于正常对照
轴分开,表明对照组与模型组主成分不同。电针组与组,模型组大鼠直立次数减少,中央距离减少;强迫游
对照组、模型组距离均较远,说明电针的作用在代谢泳不动时间延长;新奇抑制摄食潜伏时间增加,证实
WKY3
过程中对各组样本粪便的代谢物组成的影响比较显了大鼠存在抑郁行为。通过周电针干预后,电
PLS-DA4
著。在利用分析时,结果如图所见,对照针组的直立次数增加,中央距离增加;强迫游泳不动
组、模型组和电针组在正离子和负离子模式下都能明时间减少;新奇抑制摄食潜伏时间减少。研究结果表
WKY
显的区分开来。说明三组之间具有明显的组间差异,明大鼠可作为可靠的抑郁症模型进行实验研
WKY
代谢产物具有差异。因此,无论是正离子模式还是负究,同时电针可以有效改善大鼠的抑郁样行为。
PCAPLS-DA
离子模式,与方法能很好的区分各组之临床研究中,电针治疗抑郁症被证实有效的。胡
间表达差异明显的代谢物。建芳[17]等人通过中药联合针刺百会、四神聪、足三里等
4
,在治疗周后发现患者的汉密
为了分析对照组和模型组、模型组和电针组中存尔顿抑郁量表及卒中量表评分降低,脑卒中生存质量
OPLS-DA
在显著性差异的代谢物,将(正交偏最小二量表评分升高;黄娟[18]等在通过针刺百会、神门、太冲、
VIP>2
乘判别分析)分析参数且单变量统计分析参数足三里等穴配合音乐疗法治疗老年性抑郁患者的疗
P<
的代谢物作为显著性差异代谢物。如图所效观察中证明,持续治疗个疗程后有效率达
%
示,在前位显著差异代谢物中,三组共同变化的代;肖彬[19]等人在一项观察针灸配合耳穴治疗乳
710-
谢产物有种,分别是甜菜苷、环己基氨基磺酸酯、腺癌继发抑郁的临床研究中发现,针灸合谷、太冲、百
-H4-15(S)-%
氢过氧神经前列腺素、羟基二十碳三烯会、足三里、气海等穴治疗有效率为,明显高于
26--1-9-;
酸、地奥司明、,壬烷醇、氧代壬酸。其中甜对照组于海英[20]等人在研究电针治疗首发抑郁的临
菜苷在模型组中升高,在电针组中降低;环己基氨基床观察中发现,与药物组相比,针药组的汉密尔顿抑
10--H4-15(S)-
磺酸酯、氢过氧神经前列腺素、羟基二郁量表总分和各因子得分均有统计学差异,电针可有
十碳三烯酸、地奥司明在模型组中降低,在电针组中效改善首发抑郁症的临床症状群。综上,电针治疗抑
升高。郁症临床疗效显著,我们的研究能为临床提供新的治
。
KEGGKyoto
将得到的显著性差异代谢物提交至(代谢组学的研究思路与中医思维的整体观念是
EncyclopediaofGenesandGenomes
)网站用于分析可相似的,对认识疾病的发病过程,指导疾病的治疗都
6
能参与的代谢途径。如图所示,代谢产物参与的与有重要意义,也为疾病的研究开拓了的方法[21-22]。研
3PCAPLS-DA
人类有机系统的通路有条,主要是消化系统、神经系究表明代谢组学技术的模式识别分析(、)
9
统和内分泌系统;代谢相关的生物过程有条通路,主指标灵敏性较其它的技术明显提高[23],许多动物的行
要是脂质代谢、氨基酸代谢和生物素降解与代谢等途为学和形态学,甚至有限的生化指标不能表现出差别
;3
径疾病相关的网络有条通路,分别为肿瘤疾病、免时,通过运用代谢组学方法既可以将其有效分类,又
疫疾病和感染性疾病。能够寻找到与分类有关的特征性差异标志物。通过
代谢组学的方法,我们寻找到对照组与模型组存在
3讨论11559
种差异代谢物,模型组与电针组存在种差异代
KEGG
本研究通过测定强迫游泳、新奇抑制摄食和旷场谢物。通过对差异代谢物所参与的通路分析发
WKY
实验行为学改变等指标,评价抑郁大鼠的抑郁现,差异代谢产物主要参与了脂质代谢、氨基酸代谢
状态。其中强迫游泳不动时间反映大鼠的绝望状态,和生物素降解与代谢等途径,进一步说明电针干预
被广泛用于评估抑郁大鼠的抑郁样行为;新奇抑制摄后,抑郁大鼠的代谢产物发生了改变,影响了脂质代
2190〔ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica-WorldScienceandTechnology〕
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世界科学技术中医药现代化专题讨论一:针灸的作用效应临床与机制研究
ExpressionProfile&VIPofMetabolites
Deoxycholicacid3-glucuronide***
[4-(7-hydroxy-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-3-yl)phenyl]oxidanesulfonicacid**2
10-Hydroperoxy-H4-neuroprostane**1
O-Desmethylangolensin***
THYMOQUINONE***0
9-Oxo-nonanoicacid***-1
R-95913**-2
(2xi,4xi)-4,4',5,7-Tetrahydroxyflavan**
Hydratopyrrhoxanthinol***-3
5-Cholestene-3beta,7alpha,12alpha,24-tetrol***
Diosmin***
2,6-Nonadien-1-ol***
Cyclohexylsulfamate***
15(S)-Hydroxyeicosatrienoicacid***
Mono-(2-ethyl-5-hydroxyhexyl)phthalate***
Phenylalanyl-Isoleucine**
Marindinin***
Tetrahydropersin***
MG(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0/0:0)***14
BetavulgarosideVII***12
MajonosideR1*10
7Z,10Z-Hexadecadienoicacid***8
Norcotinine***6
Uzarigenin3-[xylosyl-(1->2)-rhamnoside]***4
N1,N5,N10-Tris-trans-p-coumaroylspermine***
CapsicumannuumFluorescentchlorophyllcatabolite***2
C75***
Vinylacetylglycine***
MycotoxinT2***
5-Hydroxytryptopholglucuronide***
VIP
ExpressionProfile&VIPofMetabolites
Phthalicacid*
(6R,8Z)-6-Hydroxy-3-oxotetradecenoicacid*3
4-Ethyl-5-pentyloxazole*2
BetavulgarosideVII***1
(R)-2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-2-oxo-3-indoleaceticacid**0
M-Methylbenzoate*-1
2,6-Nonadien-1-ol*-2
9-Oxo-nonanoicacid*-3
Alpha-dimorphecolicacid**
Petroselinicacid*
10-Hydroperoxy-H4-neuroprostane*
KAPA*
Oxandrolone**
Methyl-10-hydroperoxy-8E,12Z,15Z-octadecatrienoate*
TorvosideD*
Diosmin*
PG(18:0/14:0)**
Cyclohexylsulfamate***
15(S)-Hydroxyeicosatrienoicacid**6
Behenoylglycine***5
N-arachidonoyltyrosine***
3alpha-Hydroxy-5beta-chola-7,9(11)-dien-24-oicAcid***4
5alpha-pregnane-3,20-dione***3
Confertifoline*2
1-(beta-D-Glucopyranosyloxy)-3-octanone*
Pregnan-20-one,17-(acetyloxy)-3-hydroxy-6-methyl-,(3a,5b,6a)-**1
Heptadecanoicacid*
RicinoleicAcidmethylester**
21-hydroxyallopregnanolone**
ProtomycinolideIV**
VIP
图5对照组与模型组、模型组和电针组差异代谢物分析
谢、氨基酸代谢和生物素降解与代谢等代谢途径。酸、甘油三酯和甘油磷脂等脂质的异常可以诱导焦虑
脂质代谢是脂类物质在体内合成、消化与转运的和抑郁相关行为[30]。长期食用高脂肪饮食会导致非人
过程。脂质代谢异常与很多疾病有关,比如阿尔兹海类灵长类动物后代的血清素系统紊乱导致焦虑和抑
默症[24]、高血压脑病[25]、骨关节炎[26]、抑郁症[27]等。脑内郁样行为增加[31]。
存在很多特殊的脂类可以直接参与抑郁症发病的过氨基酸代谢紊乱在抑郁症中已有相关的研究进
程。脂质代谢失调会影响很多递质传递系统,其中和展,刘史佳[32]等基于抑郁患者的血清代谢组学研究发
抑郁症相关的主要包括磷脂代谢通路和***素信号现,抑郁患者血清中的苯丙氨酸、色氨酸等代谢产物
通路[28]。有研究表明,脂肪酸及一些代谢物能在脑内发生显著变化,吕梦等[33]运用核磁共振氢谱代谢组学
特定的区域内发挥作用,调节许多过程,如神经传递技术研究慢性温和不可预知应激抑郁大鼠粪便样本,
n-310
和信号通路,最终影响抑郁行为[29],多不饱和脂肪共筛选出种与抑郁相关的差异氨基酸代谢物,主要
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第二十四卷第六期
Nervoussystem
Endocrinesystem
Digestivesystem
Xenobioticsbiodegradationandmetabolism
Metabolismofterpenoidsandpolyketides
Metabolismofcofactorsandvitamins
Lipidmetabolism
Energymetabolism
Chemicalstructuretransformationmaps
Carbohydratemetabolism
Biosynthesisofothersecondarymetabolites
Pathwayclassification
Aminoacidmetabolism
Infectiousdiseases:Parasitic
Immunediseases
Cancers:Overview
Signaltransduction
Membranetransport
02468101214
Numberofcompounds
OrganismalSystemsMetabolismHumanDiseasesEnvironmentalInformationProcessing
图6差异代谢物的KEGG通路分析
涉及丙氨酸代谢、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和恐郁等情郁。目前也有研究提出“气郁体质与抑郁状
[34]
脯氨酸代谢等氨基酸代谢途径。徐雪娇等基于血清态存在相关性”[37]及“脾胃功能障碍导致的气机失调是
代谢组学技术探究电针对慢性应激抑郁大鼠代谢产抑郁症的主要病机”[38]。因此治疗抑郁症疏肝健脾和
物的影响,发现电针组的苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、胃也至关重要。针灸常选择太冲、足三里等穴位配合
丝氨酸等6种氨基酸发生变化,主要涉及相对应的氨治疗。足三里为足阳明经之合穴,足阳明经亦为多气
[35]
基酸代谢途径的改变。刘晓节等通过代谢组学研究多血之经脉,阳明经与督脉在头部交汇,百会配合足
发现了抑郁症的发病可能与能量代谢、氨基酸代谢和三里可以起到整体调节作用。体现了“调督安神”的
神经递质合成有关。张洪财[36]等利用代谢组学技术,