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专利名称:人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白及其制备方法
技术领域:
本发明属于医药生物技术领域,具体涉及一种人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)的二串体蛋白及其构建方法、制备方法,以及该二串体蛋白的表达、纯化及鉴定、在体外的生物学活性检测等方面。
背景技术:
胰高血糖素样肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是胰高血糖素原基因(proglucagon,PG)衍生肽类(P⑶P)之一,为PG转录、翻译后处理加工的含33个氨基酸的多肽,其氨基酸残基序列为:HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD。PG在胰腺A细胞和肠道L细胞都有表达,但其表达产物却因为组织特异性的加工修饰而不同。在胰腺主要产生胰高血糖素,而在肠道内主要产生P⑶P(1-160个氨基酸),P⑶P主要包括GLP-l、GLP-2、肠高血糖素、胃泌酸调节素等,而GLP-2定位于第126-158位氨基酸。GLP-2和GLP-1—样由小肠和大肠的内皮细胞分泌,GLP-2的生物学活性包括:促进小肠和大肠粘膜生长、抑制肠和隐窝细胞凋亡、促进肠内葡萄糖运输和GLUT-2表达、增加营养吸收、抑制胃排空和胃酸分泌、降低肠通透性、增高肠血流量等。除此之外,GLP-2还可促进大鼠星形胶质细胞增殖和抑制骨吸收。鉴于GLP-2的上述生物学活性,其被开发用于短肠综合征、肠型放射病等疾病的治疗。值得注意的是,
GLP-2只有以完整形式(1-33)存在时才有生物学活性,其在体内的半衰期只有7min,可被二肽激酶4(DPP4,又称为T细胞表面抗原⑶26、DPPIV等)通过识别并水解N末端的Ala而成为无活性的GLP-2(3-33),并经由肾脏排出。GLP-2通过其特异性受体GLP-2R来发挥作用,GLP-2R下游的分子机制涉及多条信号通路,目前还没有完全明确。1GLP-2的生成和降解
GLP-2是胰高血糖素原(PG)基因的表达产物,是胰高血糖素原衍生肽类(P⑶P)之一。PG基因在胰腺A细胞和肠道L细胞都有表达,但其表达产物却因为组织特异性的加工修饰而不同。在胰腺主要产生胰高血糖素,而在肠道内主要产生P⑶P(l_160个氨基酸),P⑶P主要包括GLP-1、GLP-2、肠高血糖素、胃泌酸调节素等,而GLP-2定位于第126-158位
氨基酸。GLP-2在各种哺乳动物中比较保守,仅个别氨基酸有差异。GLP-2主要由肠道L内分泌细胞合成和分泌,而且受摄食、疾病引起的肠粘膜病例损伤影响。GLP-2只有以完整形式(1-33)存在时才有生物学活性,其在体内的半衰期只有7min,可被DPP4(⑶26)通过识别并水解N末端的Ala而成为无活性的GLP-2(3-33),并经由肾脏排出。2GLP-2在肠道内的生物学功能1971年Dowling等报导一位患有胰高血糖素瘤的妇女同时表现出小肠肿大,而肿瘤切除后小肠的异常肿大
随之消失。十年之后,第二例胰高血糖素瘤伴有绒毛异常增生的病例才报导出来。据报道肠绒毛异常增生和胰高血糖素瘤的关系可以被CT检测到。这些病例使得人们对于PGDP分泌的增高及其对肠道疾病相关肠损伤的反应产生了浓厚的兴趣。尽管一系列实验证明PG基因和P⑶P的分泌升高有关,但P⑶P种类较多,具体是哪个特异因子发挥作用一直没有确定。直到有人报道在PGDP中,GLP-2具有促进肠粘膜细胞增殖的作用,对于GLP-2的研究才拉开了序幕。研究表明外源性GLP-2能促进小肠的生长。在体研究发现,GLP-2可通过增加肠上皮层的细胞数量来显著增加模型动物的肠重量,其机制是GLP-2可刺激肠隐窝上皮细胞增殖并抑制隐窝和绒毛细胞凋亡从而导致隐窝-绒毛高度增高引起的。最终,外源性GLP-2可以增加粘膜的功能表面区域。GLP-2对肠的显著作用在临床试验中也得到了证实。短肠综合症(SBS)的受试者服用六个星期的GLP-2或者三个星期的GLP-2类似物(Teduglutide)(-)可增加隐窝-绒毛高度和有丝分裂指数并且提高肠内营养的吸收。相似的,给SBS患者服用20-24周的Teduglutide()可以减少20-63%的肠道外营养。另一项研究表示通过评估血液中瓜氨酸的浓度,证明Teduglutide(-)同样可以增加Crohn’s综合症患者的肠粘膜重量和高度。有趣的是,相比外源性GLP-2对肠的生长有很强的作用,内源性
GLP-2的作用比较温和。通过应用GLP-2R的竞争性抑制剂(例如GLP-2的代谢物GLP-23-33)或GLP-2R敲除小鼠,内源性GLP-2的重要性已被证实。GLP-23-33在低浓度时是GLP-2的竞争剂,高浓度时是部分抑制剂。服用GLP-23-3324小时或者4周均可降低小肠重量和隐窝_绒毛高度。最近GLP-2促进肠功能的信号通路备受关注。研究表明GLP-2其可以⑶36依赖性的方式升高小鼠和仓鼠血液中甘油三酯和胆固醇水平,促进肠apoB48分泌。在⑶36缺陷小鼠中,GLP-2对肠脂类吸收的功能有所降低。这说明GLP-2具有CD36依赖性的促进肠内脂类吸收的功能。另有研究表明,GLP-2可增加猪和人肠系膜血流量,这是又一个有利于消化和营养吸收的机制。由于GLP-2对胃肠道的诸多有利效用,Teduglutide已进入临床试验用于治疗克罗恩病(II期)和短肠综合症(In期)()。与其它生长因子不同的是,GLP-2的促生长作用具有器官特异性(仅限于胃肠道),因此受到广泛关注。然而,在推广应用前,对于GLP-2的作用机制还有待于更深入的研究。3GLP-2作用机制GLP-2通过结合GLP-2R来发挥生物学作用。GLP-2R属于G蛋白偶联受体超家族,。它主要分布在胃肠道,在肺和下丘脑也有少量分布。虽然GLP-2对肠道的功能已经确证,但由于肠上皮细胞不表达GLP-2R,故其作用机制仍不甚明了。GLP-2R在肠上皮下的成纤维细胞
(ISEMF)表达,由此可以推测GLP-2通过GLP-2R+细胞ISEMF分泌的下游因子间接的发挥其对肠道的作用。虽然目前用于机制研究的细胞模型还不多,但GLP-2通过旁分泌因子发挥间接作用已经初步明确。研究表明角质化生长因子和内皮NOS分别是GLP-2诱导结肠生长和提高肠血流量的介导因子。最近更多的研究则集中在胰岛素样生长因子(IGFs)、ErbB网络和血管活性肠肽方面。IGFs(包括IGF-1和IGF-2)是能促进细胞增殖、分化的致有丝分裂多肽因子。IGFs有许多和GLP-2相似的功能。IGF-1基因敲除小鼠给于GLP-2处理,并没有表现出促隐窝细胞增殖、隐窝-绒毛长度和重量增加的反应,说明IGF-1在GLP-2促进小肠和大肠生长中起着关键作用。而IGF-2的作用相对较弱,只对粘膜表面有影响。进一步研究表明,GLP-2可提高小鼠肠内IGF-1的转录和翻译水平。Nelson等证明粘膜生长不仅依赖于IGF-1mRNA水平,而且还会受到GLP-23-33的抑制。然而,IGF-1在许多组织中都会产生,除了肠道外,在血液循环中也有。因此,需要更深入地探讨与GLP-2协同作用的IGF-1是否来源于肠道,如果是,源于哪种细胞?除了IGFs,ErbB配体作为GLP-2促肠作用的下游因子最近逐渐引起人们的关注。ErbB网络是一种能维持肠粘膜生长和功能的强效的增殖系统。用GLP-2处理小鼠I小时和4小时之后,小肠中ErbB配体的外调蛋白和神经调节蛋白有所上调。相似的,给予
GLP-2或者EGF可以提高ErbB配体、双调蛋白、外调蛋白等mRNA的水平,也可以激活c_fos、egr-1这些立早基因。此外,通过利用ErbB的抑制剂,证明ErbB受体在GLP-2促进肠增殖和生长中是必须的。最近,又有实验表明给予EGF可以使GLP-2R敲除小鼠肠得到重新生长。与此相反,也有人利用ErbB受体抑制剂gefitinib证明GLP-2增加肠重量和隐窝-绒毛高度的功能与ErbB信号无关。目前还不知道如何协调关于ErbB相关的发现和IGF-1-1EC-1GF-1R这条通路。有研究表明,培养肠上皮下的成纤维细胞(ISEMF)时给予GLP-2可以升高IGF-1的转录水平,而不能提高ErbB配体转录,这提示ErbB位于IGF-1下游。与此相反,外源性EGF可以使GLP-2R基因敲除小鼠肠得到重新生长,而IGF-1却不行,这又暗示IGF-1系统是EGF/ErbB的下游信号。尽管如此,IGF-1R与ErbB受体有互动关系已经得到验证,说明这两个信号通路可以相互调节。通过研究其它的细胞模型也证明了这两个通路是相互依赖的。为了说明IGF-1R和ErbB在GLP-2肠促作用中的关系,还需要更多特异性的细胞模型实验。最后,联系到粘膜下层肠神经细胞表达GLP-2R,最近有研究发现GLP-2可以通过刺激产生VIP的神经来降低肠炎和损伤。在许多有肠炎的大鼠和小鼠模型中,给予GLP-2可降低炎症因子(IFN-Y、TNF-a、IL_li3)的水平,并且可以促进抗炎因子IL-10的产生,与此同时增加小肠粘膜层表达VIP的神经细胞数量。与正常肠道中
GLP-2可以促进有丝分裂的作用形成对比,Sigalet等观察到,在炎症模型中,GLP-2介导降低肠上皮的增殖速率,使炎症向正常转化。GLP-2或VIP处理都能提高肠重量的损失并且减少肠道损伤。另外,VIP竞争剂可以阻止GLP-2的抗炎作用。通过对IL-10无效的小鼠模型的研究证明GLP-2通过一种依赖IL-10的机制发挥降低粘膜炎症和隐窝细胞增殖的功能。虽然VIP在GLP-2降低肠道炎症疾病中发挥重要作用,但具体机制仍不清楚。总之,GLP-2对肠的作用机制非常复杂,涉及多种下游因子(例如eNOS、ErbB配体、IGF-UKGF和VIP),这些因子都具有细胞特异性并且依赖生物的生理或病理状态。虽然利用动物模型实验来了解GLP-2的下游因子已经取得了许多进展,但是这些研究并不能为GLP-2R的细胞内信号机制提供信息。所以又有许多不同的细胞模型实验用来检测GLP-2R信号。与其它的B族G蛋白偶联受体一样,配体结合异种细胞表达的转染的GLP-2R可以导致cAMP剂量依赖性的升高并且激活PKA、cAMP反应元件蛋白和AP-1。此外,GLP-2对转染了GLP-2R的细胞有一种PKA依赖的促增殖作用,并且可以通过抑制糖原合酶kinase-3β和Bcl_2相关的死亡启动子来抑制凋亡。不过,利用异种和同种细胞模型得到的结果并不完全一致。虽然原代培养的小鼠粘膜细胞,肠肌肉细胞和新生小鼠内皮细胞经过GLP-2处理后cAMP水平均增高;但原代ISEMF细胞中,
GLP-2对cAMP_PKA_CREB途径并没有影响;与此相似的,HeLa细胞经GLP-2处理后cAMP水平也无变化。此外,令人意外的是,在ISEMF细胞中GLP-2调节IGF-1的转录依赖于(PI3K)Akt,而此前并没有发现该途径和GLP-2R的激活相关。事实上,虽然GLP-2同样激活IEC中的PI3K/Akt信号,但被推测并不是因为GLP-2R的直接信号,IGF-1R和ErbB受体都能刺激IEC细胞PI3K/Akt信号证实了这个假设。与此相似,虽然经典的cWnt/β-catenin信号通路最近被证实与GLP-2对体内隐窝细胞的影响有关,但有可能通过IEC-1GF-1R间接作用,而不是直接和GLP-2R相关。这个想法同样被PI3K/Akt信号通过Ser的磷酸化激活肠干细胞的β-catenin和祖细胞得到了证实。因此,虽然GLP-2可以激活IEC细胞中的多条信号通路,但目前在肠内仅发现ISEMF细胞表达GLP-2R。肠神经细胞或内分泌细胞中关于GLP-2激活的信号通路仍未见报道。4GLP-2研究中存在的问题虽然GLP-2的肠道特异性使得其比IGF-1等其它生长因子具有更大优势,但是和其它生长因子一样,GLP-2促进肿瘤形成的影响也不容忽视。Thulesen等用GLP-2喂养用1,2-DMH诱发肿瘤的小鼠,发现GLP-2组与对照组的生存率无显著差异,但GLP-2组肿瘤体积更大。Iakoubov等利用azoxymethane在小鼠中诱导肿瘤模型并研究GLP-2的促癌变作用,发现GLP-2类似物可以增加异常隐窝的聚集并导致小鼠恶性肿瘤的形成,而
GLP-2R拮抗剂,GLP-2(3-33)可以减少异常隐窝的聚集。上述实验预示着GLP-2可以促进肿瘤的形成和发展。虽然机制还不明确,但可能与cfct和PI3K/Akt途径有关。与此相反,也有体内与体外试验表明GLP-2不能促进肿瘤的形成和发展。Koehler等用人GLP-2R转染人结肠癌细胞系并研究GLP-2的促增殖和抑凋亡作用,不管是体外细胞实验还是裸鼠移植瘤模型中,都没有发现GLP-2的作·用。Bengine等利用免疫共沉淀实验研究30种结肠癌相关的肿瘤中GLP-2R的表达情况,发现只有在正常的粘膜细胞中有表达。因此,虽然GLP-2和其类似物在治疗肠道疾病时功效显著,但其致癌性还存在争议,仍然需要更深入的调查研究才能确认其安全性。GLP-2是一种肠上皮特异性因子,在治疗肠道疾病时作用明显,目前GLP-2类似物Teduglutide治疗短肠综合症已经进入了III期临床试验。但是关于GLP-2发挥作用的分子机制还不清楚,这也是目前研究的重点和难点。此外,关于GLP-2促癌作用的争议也会影响GLP-2及其类似物进入临床应用。因此,只有明晰GLP-2作用的分子机制,才能避免GLP-2治疗肠道疾病时潜在的安全隐患。
发明内容
本发明的目的是将无法在大肠杆菌中直接表达的人胰高血糖素样肽-2以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达,并且提供一种人胰高血糖素样肽-2二串体蛋白的制备方法,此方法制备的人胰高血糖素样肽
-2二串体蛋白具有生物学活性,促进Caco-2细胞(人结肠癌上皮细胞)的增殖,活性优于化学合成的单体,为其广泛应用奠定基础。本发明的目的之一是提供一种重组的、分离的或合成的二串体蛋白,该二串体蛋白由两个人胰高血糖素样肽-2(GLP-2)通过连接肽连接获得。本发明对GLP-2的氨基酸序列进行了优化,用Gly代替第二位氨基酸(Ala)后,再用连接肽将突变序列进行串联设计,获得的GLP-2二串体蛋白既能保持生物学活性,又可延长体内或体外的半衰期。所述的二串体蛋白,其特征在于,所述连接肽为Gly-Ser。所述的二串体蛋白,其中所述人胰高血糖素样肽-2的基因序列为I)6)中任一种:I)SEQIDNO:1所示的序列;
2)DNA分子,其编码与SEQIDNO:1所示序列所编码的多肽相比,具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽;3)与SEQIDNO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其酶活性片段的序列;4)与SEQIDNO:1所示序列互补的序列;5)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQIDNO:1所示序列的序列之一。6)编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的基因序列。所述的二串体蛋白,其中所述二串体蛋白为以下任一种:I)其编码基因序列为SEQIDNO:2所不的序列;2)SEQIDNO:2所不序列编码的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而衍生的多肽。所述的_