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专利名称:与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及生物技术领域中与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术:
不良自然环境,如低温、高温、干旱和盐渍等作用于植物会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应,表现为代谢和生长的可逆性抑制,严重时甚至引起不可逆伤害,从而导致整个植株死亡。各种胁迫中,干旱、盐碱、冷(冻)害对植物的影响尤为突出,是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。利用基因工程手段改良作物的低温耐性,尽量避免或减轻不良环境因素的危害,是当前生物和现代农业技术领域的研究热点,也是我国以及世界农业急需解决的重大课题。植物对胁迫的抵抗和忍耐能力称为抗逆性,抗逆性是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性。多年来,人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度进行了大量研究,积累了丰富的资料,特别是随着分子生物学的发展,人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐逆性机理,为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性,采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难,随着分子生物学的发展,基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径,但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。过去,抗逆基因的克隆及应用主要是单一的功能基因,如甜菜碱合成酶基因、脯
氨酸合成酶基因等,虽然取得了一定的效果,但植物的抗逆性没有得到全面的提高。植物抗逆性受多基因控制,要使众多对植物抗逆性状产生影响的功能基因充分表达和发挥作用,才能更有效的改良植物的抗逆性。随着生物技术的不断发展,研究重点已经从一般的功能基因转向各种专一性或高效性的调控因子(如启动子和转录因子)。由于一个转录因子可以调控植物中多个与抗逆性相关基因的表达,增强一个转录因子的作用,就可使植株的抗逆性状获得综合改良。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白,名称为LcMYB13355,来源于羊草(Leymuschinensis),是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因为如下
1)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列2自5’末端起第133位到第2388位核苷酸所示的DNA分子;
2)序列表中序列2所示的DNA分子;3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因;
4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述严格条件可为用6XSSC,%SDS的溶液,在65°C下杂交,然后用2XSSC,%SDS和1XSSC,%SDS各洗膜一次。序列表中的序列2由沈97个碱基组成,其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第133-2388位碱基,编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体是在P3301-121载体的多克隆位点间插入所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体;所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切,回收载体大片段;(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切,回收包含⑶S基因的片段;(3)将步骤⑴中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含⑶S基因的片段连接,得到重组载体P3301-121。所述pCAMBIA3301载体购自CAMBIA公司;所述pBI121载体购自Clontech公司。所述重组菌为重组酵母菌。扩增
所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中,一条引物序列如序列表中序列3所示,另一条引物序列如序列表中序列4所示。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法,是将所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因导入目的植物中,得到抗逆性增强的转基因植物。所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物;所述双子叶植物为拟南芥;所述抗逆性为对低温、高盐、干旱、脱落酸和/或茉莉酸甲酯的抗性;所述低温为4°C。可用现有的植物表达载体构建含有LcMYB13355基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等,如pCAMBIA1302、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的羊草低温诱导转录因子编码基因LcMYB13355的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是小麦、水稻、玉米、短柄草等单子叶植物,也可以是拟南芥、烟草、大豆、黄瓜、番茄、棉花、杨树、苜宿等双子叶植物。本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的表达受干旱、低温、高盐或ABA等逆境诱导,可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应,提高植物的抗逆性。与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义。
图1为经4°C低温处理的羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2为PCR扩增LcMYB13355的3,端序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图3为PCR扩增LcMYB13355的5,端序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图4为PCR扩增LcMYB13355全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图5为LcMYB13355基因在不同低温、高盐、干旱和刈割等胁迫条件下的诱导表达结果。图6为LcMYB13355基因的组织特异性表达分析结果。图7为LcMYB13355基因的转录激活活性分析结果。图8为重组表达载体p3301-121_LcMYB13;355的构建过程图。图9为低温胁迫处理条件下转LcMYB13355基因拟南芥的生长情况。图10为p3301-121载体的构建过程。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1、与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因的获得和功能验证一、与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因的获得1、LcMYB13355基因的3,端序列的克隆(1)植物材料处理及总RNA的提取以羊草(吉生一号,购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料,4°C处理6小时和12小时后,混合6小时和12小时两个不同处理时间的样品,提取其总
RNA,进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示。结果表明,所提取的RNA有两条明显的电泳条带,从上到下依次为^SRNA和18SRNA,表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。(2)LcMYB13355基因3,端序列的克隆根据GS-FLX454(简称454)测序羊草MTO的氨基酸残基序列设计引物,具体的引物序列如下LC13355racef5'-GCCAAATCGCCACCTCAAAGTGACA-3‘,以上述步骤(1)提取的经低温处理的羊草幼苗的总RNA为模板,用PrimeScriptlstStrandcDNASynthesizedKit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书的要求,反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下01igO-dT(10pmOl/μ1)1μ1,TotalRNA(彡1μg)2μ1,dNTPMixture(IOmmo1/1each),,RNaseInhibitor(40U/μ1),PrimeScriptRTase(200U/μ1),RNase-freedistilledwater11μ1;65°C5min,42°C45min,70°C15min。将合成的第一链cDNA贮存于-20°C备用。再以获得的第一链cDNA为模板,引物LC13;355racef与引物OligodT-adaptor5‘-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3‘配对进行PCR扩增;PCR反应体系为cDNA模板、弓丨物LCl与弓丨物OligodT-adaptor各1μ1,,dNTPMixture(IOmmo1/1each)2μ1,Taq酶0·25μl,
;反应条件为先94°C预变性5min;然后94°C30s,55°C30s,72°C60s,共36个循环;最后72°C延伸lOmin。
反应结束后,对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示。其中,泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准,泳道1为3’RACEPCR扩增产物,结果表明,经PCR扩增获得了长度约为1300bp左右的目的片段。回收并纯化3’RACE产物,将其连接到PMD-18T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定,提取阳性克隆的质粒进行测序,对测序结果进行BLAST分析。结果表明,该片段的长度为1346bp,该片段的序列与植物中已知的MTO类基因的3’端序列具有较高的同源性,表明该片段可能为羊草MTO类结合蛋白编码基因的3’端序列。2、LcMYB13355基因5,端序列的克隆根据上述步骤一获得的LcMYB13355基因3,端cDNA序列设计引物13355racer5'-TTCGTTCCAGCAGCCCCCAGTCGTCG-3‘,以步骤1提取的经低温处理的羊草幼苗的总RNA为模板,采用!Iomega公司的5’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书,反转录合成其第一链cDNA。反应体系及条件如下1μ1RNA,1μ15'-CDSprimerA,1μ1SMART11Aoligo,1μ1DTT(20mM),1μ1dNTPMix(IOmM),1μ1MMLVReverseTranscriptase,2μ15XFirst-StrandBuffer,2μ1sterileH2O
;70°C2min,冰上2min,42°,72°C7min。以获得的第一链cDNA为模板,引物13355racer与引物UPM(Promega公司Long():5‘-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘,Short(2μΜ)5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘)配对进行PCR扩增;PCR反应体系为1μ150ΧAdvantage2PolymeraseMix,-GradeWater,5μ1IOXAdvantage2PCRBuffer,1μ1dNTPMix(IOmM),1μ150XAdvantage2PolymeraseMix,5μ1UPM,1μ1引物R,;反应条件为先94°C30s,然后68°C30s,70°C60s,共40个循环;最后70°C延伸lOmin。反应结束后,对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图3所示。其中,泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准,泳道1为5’RACEPCR扩增产物,结果表明,经PCR扩增获得了长度约为1600bp的目的片段。回收并纯化5’RACE产物,将其连接到PMD-18T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞,筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定,提取阳性克隆的质粒进行测序,对测序结果进行BLAST分析。结果表明,该片段的长度为1597bp,该片段的序列与植物中已知的MTO类基因的5’端序列具有较高的同源性,表明该片段可能为羊草
MTO类结合蛋白编码基因的5’端序列。3、LcMYB13355基因全长cDNA序列的获得及PCR检测利用上述步骤1和步骤2获得的长度为1346bp和1597bp片段之间的重叠区,借助Contig软件拼接得到的LcMYB基因的全长cDNA序列,其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由沈97个碱基组成,自5’端第133位-第2388位为编码序列,编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质,序列表中序列1由751个氨基酸残基组成。根据LcMYB基因全长cDNA序列设计如下引物13355fullf5'-CTCCAAATCCCTAACTCCCCAAT—3‘禾口13355fullr5'-GACTCCAATTGACCCAAGCTC-3‘。以上述步骤一提取的经低温处理的羊草幼苗的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板,进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图4所示。其中,泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准,泳道1为PCR扩增产物。结果表明,经PCR扩增获得了长度约为2700bp的片段。回收并纯化该产物,将其连接到PMD-18T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定,提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明,该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列在扩增部分完全相同,PCR扩增产物序列全长为267^ρ,表明所克隆的3’RACE片段和5’RACE片段属于同一基因,将该基因命名为
LcMYB13355,该基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示;将该基因编码的蛋白命名为LcMYB13355,该蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。二、LcMYB13355基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析将正常生长8周的羊草(吉生一号,购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗分别进行不同时间(0、、3、6、12、对和48小时)的低温(4°C)、高盐(400mMNaCl)、干旱(20%聚乙二醇6000)、脱落酸(ΑΒΑ,100μΜ)及茉莉酸甲酯(MJ,100μΜ)胁迫处理。分别将各处理不同时间的样品混合,提取各处理的羊草幼苗的总RNA,半定量PCR方法分析LcMYB13355基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式,结果如图5所示,图5中NaCl代表盐胁迫、PEG代表干旱胁迫、ABA代表脱落酸胁迫、MJ代表茉莉酸甲酯胁迫、cold代表低温胁迫。结果表明,LcMYB13355基因的转录水平明显受低温和盐胁迫的诱导。三、LcMYB13355基因的组织特异性表达分析分别提取实施例1中经低温胁迫处理的羊草幼苗的根、根茎、叶鞘、叶、茎、根茎芽和幼穗七种组织的总RNA,利用引物5‘-AATCGCCACCTCAAAGTG-3‘和5'-TGTATTAGCAACAAGCAGCC-3‘进行RT-PCR分析,同时以Actin基因作为内标。反应结束后,对RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图6所示。结果表明,LcMYB13355基因在不同组织中的表达存在明显差异,以叶鞘中表达量最低,茎、叶和根中含量其次,根茎芽、幼穗和根茎中表达量较高。四、