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专利名称:不含选择性标记基因的转质体植物的制作方法
不含选择性标记基因的转质体植物
本发明涉及不含选择性标记基因的转质体(transplastomic)植物、获得
这种植物的方法和所用载体。
植物转基因由将源自各种生物(细菌、病毒、昆虫、植物)的一种或多种基因引入植物组成,其目的是为该植物提供新特性或提高某些农业或食品质量。随着常规基因转化技术的发展,大量的各种基因已经导致新的植物品种的产生。在某些情况下,由于引入了产生除草剂抗性、病原体抗性或各种应激抗性的特征,可有利于农作物生产并提高产量。在其它情况下,可提高该植物的营养价值和某些基础化合物的含量。
许多用于获得稳定的转基因植物的技术包括将外来基因引入该植物的核基因组。然而,整合入宿主植物核染色体的外来基因可通过花粉散布给野生种类。因此,降低转基因散布到环境中的风险的方法是非常有益的。
获得转基因植物的另一种方式是直接转化质体。具体说,质体转化有许多优点,其中可注意
-通过双同源重组将基因插入各个细胞中存在的一个或多个拷贝的环状质体基因组(或质体组)的质体转化具有通过位于转化
载体中转基因任一侧的质体序列将感兴趣的基因精确靶向至质体组中所需区域的优点。这种精确耙向避免了核转基因过程中通常所观察到的"位置"效应。
-每个细胞获得非常大量拷贝的转基因。具体说,根据发育阶段,叶片细胞可含有高达10000个拷贝的120-160千碱基的小环状基因组,每个分子携带一个大的重复序列。随后可操作植物细胞,以使其含有高达20000个拷贝的感兴趣基因。
这导致高水平表达;转基因产物可能占总可溶性蛋白质的40%以上(DeCosa等,2001)。
-质体转化具有其它优点,它能大大限制转基因散布到环境中的风险。由于质体中所编码的特征通常不能通过花粉传播,限制了转基因传播给野生物种的潜在风险。McBride等(1994)的文章;美国专利号5,451,513;5,545,817;5,545,818和5,576,198以及国际专利申请WO95/16783和WO97/32977描述了质体转化技术。最初在单细胞藻类莱茵衣藻(C/7/flmj^omomwre/"Aa^"/)中用生物射弹进行质体转化(Boynton等,1988),此方法已经延伸至烟草(Svab等,1990)。
常规的质体转化技术包括用连接有DNA的微粒轰击叶片(Svab等,1993)。
目前,仅在烟草植物普通烟草(Mto&ram)中进行高等植物质体的稳
定转化(Svab和Maliga,1990;Svab等,1993)。然而近年来,水稻(Khan和Maligna,1999)、拟南芥(Jra6Zt/o/w^Afl/&"a)(Sikdar等,1998)、马铃薯(Sidorov等,1999)、油菜籽(Chaudhuri等,1999)和番茄(Ruf等,2001)
的质体转化取得了一些进展。获得了烟草、番茄、马铃薯和大豆的可繁殖的转质体植株(WO04/053133)。
直接质体转化已经用于获得对除草剂具有良好耐受水平或对昆虫的抗性,或者产生大量蛋白质。因此,烟草质体组的除草剂如草甘膦(Daniell,1998;WO99/10513;Ye等,2000;WO01/04331,WO01/04327)或草***膦(Basta)(Lutz等,2001)的耐受基因过度表达产生了对这些除草剂出色的耐受性。其它应用导致产生对昆虫耐受或过量产生治疗性蛋白的转质体植物(McBride等,1995;美国专利5,451,513;Staub等(2000);WO99/10513)。
然而,如常规进行的高等植物质体的直接转化的一个主要缺点是采用抗生素抗性基因作为选择性标记。
通常用于选择转质体品系的选择性标记是细菌基因^W,它在质体调控元件的控制下表达(Svab等,1993;Staub等,1993)。编码氨基糖苷3'-腺苷转移酶的""^4基因的表达产生两种抗生素抗性,即壮观霉素和链霉素抗性。afl^L4基因产物防止壮观霉素(或链霉素)结合于质体核糖体30S亚
基的部件16SRNA(参与识别翻译起始密码子),从而防止了抑制质体内的翻译。仅有含有表达基因产物的质体的细胞能够继续在体外最优地生长并保持绿色。另一种选择性标记是具有点突变的16SRNA序列,此点突变使其对壮观霉素不敏感。
不幸的是,这种抗生素也控制人和动物中的细菌感染。因此,转基因
作物中抗生素抗性基因的存在所伴随的健康和环境的潜在风险引起了大量忧虑。因此,人们主要关心可以清除选择性标记基因,特别是抗生素标记基因,同时将感兴趣的基因保持在转基因植物中的方法。
已经对一定数量的复杂程度或高或低的技术进行了描述,以用于清除整合入染色体的选择性标记基因。如果标记基因未遗传连接于感兴趣基因,人们可以希望通过杂交和后代分析清除该基因。当选择性标记为遗传
连接时,可采用其它技术,如基于釆用转座因子(PCT/US91/04679;Yoder等,1993)或采用位点特异性重组系统如Pl噬菌体的c//ox系统或酵母FLP/FRT系统(FliPase重组酶;Lyzrik等,1997)的技术。
通过其转运肽将编码靶向叶绿体的CRE蛋白的第二种转基因引入该植物的核基因组中(EP1218488),位点特异性重组也已应用于清除转质体标记基因,。
在莱茵衣藻中,基于光合突变体的选择方法使得不用抗生素选择性标记基因如aa^L4将感兴趣的外来基因引入质体基因组成为可能。然而,这些方法不可用于高等植物,因为它们基于光合突变体的存在。
作为质体基因组转化基础的双同源重组现象也可用于随后清除部分转基因,尤其是选择性标记。描述了衣藻(Fischer等,1996)和烟草(WO01/81600)中这种清除的原理。所用技术由用含有取向相同的感兴趣基因和其边界是两个相同DNA序列的选择性标记基因的核酸序列转化质体基因组组成,所述两个相同DNA序列的长度足以激活同源重组系统。通过在对应于所用选择性标记基因的第一种选择培养基上培养对转化事件进行选择。在选择培养基中增殖愈伤组织,以获得所有质体基因组含有选择性标记基因和感兴趣基因的同质植物。随后在非选择性培养基中培养植物及其后代,以消除选择性标记基因。
在拟南芥中已经使用了对己经清除标记基因的植株进行选择的系统,但它涉及核基因组的转化(WO01/96583)。在这种方法中,用在阳性选择性标记基因和阴性选择性标记基因周围含有取向相同的两个拷贝的感兴趣基因的载体转化植物。阳性选择性标记基因能够选择将转基因掺入其基因组的事件。存在两个拷贝的感兴趣基因使得可能通过同源重组清除这两种(阳性和阴性)选择性标记基因,同时清除两个拷贝感兴趣基因中的一个拷
贝。然后,通过在阴性选择性标记上培养选择已经经过这种同源重组的事件,阴性选择性标记能阻止仍然含有相应选择性标记基因的细胞生长。这种阴性选择性标记基因的例子是CooL4(大肠杆菌(&c/zen'cWaco/0胞嘧啶脱氨酶),它使5-***胞嘧啶(非毒性)脱氨形成有毒的5-***尿嘧啶。
在本申请内容中,作者成功开发了一种方法,其包括在质体转化过程中选择已清除标记基因的植株。此方法能够可靠地获得存在感兴趣基因和不存在选择性标记(特别是抗生素选择性标记)的同质事件。该方法也具有以下优点感兴趣基因的表达与标记基因的清除有关并依赖于标记基因的清除,以及这种清除在重组期间除了感兴趣基因以外不会留下任何其它外源性DNA。该方法也有以下显著优点当感兴趣基因的表达提供了选择性特征时,促进或加速感兴趣基因存在同质植物的生产。例如,当感兴趣的基因是耐受除草剂如异嚼唑草***、草甘膦或草***膦(Basta)的基因时,就是这种情况。
图1:质粒pCLT146的图谱发明详述
本发明主题是获得不含选择性标记,特别是抗生素选择性标记的转质体植物的方法,所述方法至少包括以下步骤
a)用适合转化质体的载体转化至少一个植物细胞,所述载体在转录方
向上包含对应于感兴趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含编码对选择剂
产生抗性的选择性标记的序列的嵌合基因(ii)、与序列(i)的3'部分相同的n个核苷酸的片段(iii)、对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv);
b)在含有选择剂的第一种培养基上培养包含转化质体的细胞;
c)在不含选择剂的第二种培养基上培养细胞。
应理解,按照本发明,上述方法的步骤a)所用载体不包含完整形式的感兴趣的嵌合基因。
术语"完整形式的感兴趣的嵌合基因"或"完整的感兴趣的嵌合基因"指感兴趣的基因的非截短序列。
在具体实施方式
中,n代表至少25个核苷酸,优选至少30个,优选至少50个核苷酸。
术语"适用于转化植物的载体"可以指(例如)包含用于与植物质体组同源重组的两个区域的转化载体,这两个区域形成如本发明所述的遗传构建物或构建物的边界。
定位于所述基础嵌合基因上游(LHRR)和下游(RHRR)的这些区域,能够与含毗连LHRR和RHRR区的质体组的基因间区进行双同源重组。
优选地,本发明的两个同源重组区对应于能够将嵌合基因整合入质体组基因间区的毗连序列。在具体实施方式
中,此区域对应于质体组核糖体RNA操纵子的区域。在另一具体实施方式
中,此基因间区包括编码Rubisco大亚基的rbcL基因的3,末端和包括编码乙酰基-CoA-羧化酶的亚基的accD基因的5'末端的另一个同源序列。此外,更具体说,此基因间区包括对应于普通烟草PetitHavana变种()质体组的核苷酸57755-59297的编码Rubisco大亚基的r6cL基因的3,末端,,另一同源序列包括对应于普通烟草PetitHavana变种质体组的核苷酸59298-60526的accD基因的5'末端,。
术语"感兴趣嵌合基因的其余3'部分"指序列(i)和序列(iv)在转录方向上并列重建了整个感兴趣的嵌合基因。
术语"感兴趣的嵌合基因"指一种核苷酸序列,其包含在质体中有功能的调控启动子序列、编码感兴趣蛋白的序列和在植物细胞质体中有功能的终止子,它们在转录方向上彼此功能性连接。
术语"包含编码选择性标记的序列的嵌合基因"指一种核苷酸序列,其包含在质体中有功能的调控启动子序列、编码选择性标记的序列和在植物细胞质体中有功能的终止子,它们在转录方向上彼此功能性连接。
术语"嵌合基因"通常指其中某些元件不存在于天然基因中,但取代了天然基因中存在的元件或加入了某些元件的基因。
本发明所用术语"嵌合基因"也可对应于天然基因中存在所有基因元件的情况,或者,术语"基因"可对应于嵌合基因。
也可存在其作用在于提高转化基因的表达或功能的其它元件,如内含
子、增强子、聚腺苷酸化序列和衍生物,以提高基因表达。
术语"彼此功能性连接"指所述嵌合基因元件以彼此相连的方式使它们的功能协调且能表达编码序列。例如,当能确保所述编码序列表达时,将启动子与编码序列功能性连接。构建本发明嵌合基因和其各种元件的装
配可用本领域技术人员熟知的技术完成,具体如Sambrook等(1989,《分子克隆实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),,,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress)所述技术。组成嵌合基因的调控元件的选择主要取决于它们必须在其中起作用的植物和质体的类型,本领域技术人员能够选择在给定植物中起作用的调控元件D
在植物细胞的质体中有功能和可用于实施本发明的启动子中,可以提及(例如)编码PSII的Dl蛋白的基因的启动子(Staub等,1993,EMBOJournal12(2):601-606)或核糖体RNA操纵子Prrn的组成性启动子(Staub等,1992,PlantCell4:39-45)或与烟草r^L基因5'非翻译区的5'部分结合的烟草Prrn启动子(Svab等,1993,/.Jcad90:913-917)
。通常,衍生自植物质体组基因或细菌基因的任何启动子都合适,本领域技术人员能够在可获得的各种启动子中作出合适的选择,以获得所需表达方法(组成型或诱导型)。
在植物细胞的质体中有功能的终止子中,可以提及(例如)戸W基因的终止子、编码Rubisco大亚基的AcL基因或编码烟草核糖体蛋白的基因(Shinozaki等,1986;Staub等,1993)。
包含编码选择性标记的序列的嵌合基因可用于选择有效转化的质体和细胞,即将嵌合基因掺入其质体组的质体和细胞。通过在含有选择剂的培养基上培养转化的细胞或组织选择转化子。
常用的选择性标记基因包括编码对抗生素、除草剂或其它化合物有抗性的基因的基因,这些物质可能对不表达抗性基因或等位基因的细胞、细胞器或组织是致命的。那么,选择剂是相应的抗生素、除草剂或选择性化合物。如果所述物质对细胞是致命的,那么在这种培养基上只有转化细胞能存活并发展,而非转化细胞会死亡。如果选择剂对细胞不致命,就根据可能显示出的不同行为区分转化细胞和非转化细胞。
选择性标记可能在细胞水平不致命,但在细胞器水平致命。例如,抗生素壮观霉素在质体中,而非胞质中抑制mRNA翻译成蛋白质。含有非抗