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大肠杆菌的表达载体
克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素
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大肠杆菌表达体系
克隆基因正确表达的基本条件
克隆基因表达活性的检测
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,特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解;
全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架
,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体;
、高水平的表达;
、操作简单、成本低廉,易用于批量生产。
优越性:
大肠杆菌表达体系
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,在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。
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细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。
,影响真核基因mRNA稳定性。
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系的不足
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,都要经过转译后的加工修饰(正确折叠和组装),而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在;
,能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子,并把它们降解掉。
大肠杆菌表达体系
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最基本条件:应该能够进行正常的转录和转译,以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。
重要条件:编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。
克隆基因正确表达的基本条件
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具有核糖体结合位点;
具有克隆基因的功能(强)启动子;
插入序列的正确取向。
克隆基因正确表达的基本条件
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;
;
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克隆基因表达活性的检测
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这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。
微细胞:指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。
微细胞检测法
克隆基因表达活性的检测
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通过蔗糖梯度离心将微细胞与正常细胞分开,含有质粒载体的微细胞是适于检测重组子质粒所携带的外源基因表达状况的理想体系。
克隆基因表达活性的检测
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