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专利名称:一种高效抗氧化剂-马铃薯蛋白抗氧化肽的制备方法
技术领域:
本发明提供了一种新型高效抗氧化剂一马铃薯蛋白抗氧化肽的制备方法,属于农产品精深加工领域,马铃薯蛋白抗氧化肽可作为功能性添加剂用于食品和化妆品。
背景技术:
马铃薯是继大米、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物。中国是世界上马铃薯种植面积最大的国家。马铃薯由于淀粉含量高,是淀粉工业的原料之一。在生产淀粉的过程中,产生了大量的废水。这些废水中富含蛋白质和一些多糖,COD(化学耗氧)值较高,直接排放则会造成环境污染。为了减少淀粉生产废水排放对环境的损害,实现废弃资源的有效利用,淀粉工业则从这些废水中回收有价值的一些物质,如马铃薯蛋白。工业上对马铃薯蛋白的回收一般采用酸沉淀结合高温热处理的方法,这种方法极大损害了马铃薯蛋白的品质,特别是其溶解性。因此,工业生产获得的马铃薯蛋白品质较低,通常被用于做为动物饲料,产品附加值不高。而马铃薯蛋白是一种氨基酸比例很平衡的蛋白来源,有较高的营养价值和潜在的功能品质。为了提高马铃薯蛋白的工业附加值和进一步拓宽马铃薯蛋白的应用领域以及提升工业马铃薯蛋白的应用价值,通过酶解的手段将马铃薯蛋白水解成溶解度高
且具备一定功能的多肽产品则是一种十分有效的途径。对马铃薯加工业来讲,可以使其产业链得到进一步延伸,由淀粉加工延伸至马铃薯蛋白的加工,进而延伸到马铃薯蛋白产品的应用开发;可以改善马铃薯副产物的品质,拓宽马铃薯蛋白的应用范围,提高马铃薯副产物的附加值,使这部分废弃物得到综合利用;可以减少马铃薯淀粉工业高营养废水的排放,减少废水排放带来的环境污染问题,使马铃薯淀粉企业实现清洁生产,这些对企业提高自身的科技含量和社会责任感,拓宽企业的产品线都有极其重要的经济意义和社会意义,也符合目前植物来源蛋白深加工的发展方向。目前,关于马铃薯蛋白抗氧化肽的报道较少,国外关于马铃薯蛋白抗氧化的报道主要是利用水解后的粗混合物测定清除自由基能力、还原力以及螯合自由基能力,并将其应用于肉糜体系和模拟法兰克福香肠体系,合成马铃薯蛋白的抗氧化肽用于动物实验。国内还未见马铃薯蛋白抗氧化肽作为抗氧化剂的报道。本发明产品分子量分布范围在1001034Da,能够清除自由基,延缓食品乳状液中脂肪的氧化,提高产品的货架期,是一种安全的可作为抗氧化剂的马铃薯抗氧化肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型高效抗氧化剂——马铃薯蛋白抗氧化肽的制备方
法,所得产品可以高效抑制水包油乳状液中脂肪氧化,提高乳状液的氧化稳定性。本发明的技术方案一种高效抗氧化剂——马铃薯蛋白抗氧化肽的制备方法,以工业马铃薯蛋白为原料,用水配制悬浊液,调pH后加入碱性蛋白酶Alcalase进行酶解,灭酶冷却,离心微滤,滤液经真空浓缩后用凝胶色谱柱分离,洗脱的组分经冷冻干燥得到三种马铃薯蛋白抗氧化肽,肽结构分别为YFE(Tyr-Phe-Glu)、NYKQM(Asn-Tyr-Lys-Gln-Me)及TY(Thr-Tyr),分子量分布范围1001034Da;(1)工业马铃薯蛋白原料其蛋白含量大于或等于80%;(2)配制悬浊液马铃薯蛋白粉加水搅拌,制成40g/L蛋白悬浊液;(3),温度4852°C,调pH后加入碱性蛋白酶Alcalase进行酶解,酶活为400000u/mL,酶/底物(蛋白粉干基计)以mL//100,600-800r/min搅拌酶解lh,;(4)灭酶冷却将所得酶解液升温加热至80°C,保温15min灭酶,快速冷却;(5)离心微滤酶解液经5000r/min离心25min,;(6),温度4550°C下真空浓缩至固形物含量50%以上;(7)凝胶色谱柱分离以S^hadexG15为填料填充层析柱,以蒸馏水为洗脱剂平衡填充好的层析柱1216h后备用;将检测器波长设定在280nm,取8IOmL步骤(6)所得的浓缩液加入填充SephadexG15
填料的凝胶层析柱进行分离,以蒸馏水为洗脱剂,,打开记录仪在记录仪上记录凝胶层析柱组分洗脱的信号,随着洗脱的进行记录仪记录下不同的洗脱峰,等到记录仪上记录的信号值和初始时的信号值接近时,平衡一个柱体积后结束分离过程,按照记录仪上记录下的不同洗脱峰分别收集相应的样品,得到不同分子量分布的组分,多次重复上样,将收集到的同一种组分合并;共收集得到三个组分,结构分别为YFE(Tyr-Phe-Glu)、NYKQM(Asn-Tyr-Lys-Gln-Me)禾口TY(Thr-Tyr),分子量分布范围为1001034Da;(8)冷冻干燥将得到的收集组分冷冻干燥,冷冻干燥真空度为1030Pa,温度-30_55°C,干燥时间48h,水分含量低于5%,干燥后得到的产品即为马铃薯蛋白抗氧化肽。马铃薯抗氧化肽产品的ABTS+‘自由基清除能力测定是按如下方法进行(I)ABTS+-(最终浓度)混合。在室温、避光条件下静置16h,形成ABTS+·自由基储备液。()稀释成工作液,。(2)ABTS+-自由基清除能力测定20μL样品液与1980μLABTS+'自由基工作液混合,反应IOmin后在734nm测定吸光度值,以超纯水为空白。ABTS+-自由基清除能力=[(空白样品吸光值-样品吸光值)/空白样品吸光值]X100%马铃薯抗氧化肽产品延缓乳状液中脂肪氧化能力的测定是按如下方法进行
(1)乳状液的制备将10衬%大豆油和90wt%水相溶液用高速分散机在21,500r/min下乳化2min,再将乳化液用ATS高压均质机(ATSEngineeringInc.)在32MPa均质两次,%NaN3作为抑菌剂。%Tween20溶于水解马铃薯蛋白不同G15柱分离得到的产品溶液(,)。(2)乳状液的氧化乳状液的氧化使用烘箱法进行氧化。将乳状液分装在20mL带盖的玻璃瓶中,用铝箔纸包裹,放入隔水式培养箱中37°C氧化。定期测定体系丙二醛值。丙二醛的测定方法如下配制硫代巴比妥酸(TBA)溶液(,15g三***乙酸,,加入3mL2%BHA(丁基羟基茴香醚)溶液(溶于乙醇)混勻),取2mLTBA溶液,,在沸水浴中加热15min,取出在自来水中冷却到室温,5000r/min离心25min,取上清液在532nm处比色。以1,1,3,3_四乙
氧基丙烷做标准曲线,确定样品中的丙二醛值。本发明的有益效果本发明所得产品是通过酶解等方法制备得到的一种新型高效抗氧化剂,产品的安全性较合成抗氧化剂高,可以有效延缓乳状液中脂肪的氧化,制备方法简单,适合工业化生产,本发明对于提高马铃薯蛋白的工业附加值,推进马铃薯蛋白的深加工,延伸马铃薯加工的产业链,综合利用马铃薯资源有着重要的经济价值和社会意义。
图1产品的ABTS自由基清除能力。由图1显示G15精制得到的几个组分都有一定的清除自由基的能力,而组分3(峰3)浓度为lmg/mL时清除自由基的能力比5mg/mL的原液还要高,因此具备较高的抗氧化能力,可用于延长产品的货架期或提高产品的抗氧化能力。图2产品的提高乳状液氧化稳定性能力。由图2显示,G15精制分离得到的组分3(峰3)浓度为lmg/mL时比5mg/mL的原液延缓脂肪氧化能力还略强,和对照相比更是可以有效抑制脂肪氧化,使产品在货架期内有更好的品质,可作为一种高效的抗氧化剂。
具体实施例方式实施例1取马铃薯蛋白粉64g溶解在1600mL去离子水中,将马铃薯蛋白溶液(4%,w/v),,酶活为400000u/mL,用Alcalase酶在50°C、600-800r/min搅拌酶解Ih。水解结束后,,80°C灭酶15min。5000g离心25min分离酶解液,,得到透过液。,温度48°C下进行真空浓缩,浓缩至固形物含量50%以上。将浓缩液加入填充Si^phadexG15填料的凝胶层析柱进行分离,得到不同分子量分布的组分,多次重复上样,将收集到的同一种组分合并,在_40°C预冻后进行冷冻干燥,冷冻干燥真空度为30Pa,冷冻干燥温度-50°C,干燥时间
48h,得到马铃薯蛋白抗氧化肽。实施例2取马铃薯蛋白粉64g溶解在1600mL去离子水中,将马铃薯蛋白溶液(4%,w/v),,酶活为400000u/mL,用Alcalase酶在48°C、600-800r/min搅拌酶解Ih。水解结束后,,80°C灭酶15min。5000g离心25min分离酶解液,,得到透过液。,温度48°C下进行真空浓缩,浓缩至固形物含量50%以上。将浓缩液加入填充Si^phadexG15填料的凝胶层析柱进行分离,得到不同分子量分布的组分,多次重复上样,将收集到的同一种组分合并,在_40°C预冻后进行冷冻干燥,冷冻干燥真空度为30Pa,冷冻干燥温度-50°C,干燥时间48h,得到马铃薯蛋白抗氧化肽。实施例3取马铃薯蛋白粉64g溶解在1600mL去离子水中,将马铃薯蛋白溶液(4%,w/v),,酶活为400000u/mL,用Alcalase酶在52°C、600-800r/min搅拌酶解Ih。水解结束后,,80°C灭酶15min。5000g离心25min分离酶解液,,得到透过液。,温度48°C下进行真空浓缩,浓缩至固形物含量50%以上。将浓缩液加入填充Si^phadexG15填料的凝胶层析柱进行分离,得到不同分子量分布
的组分,多次重复上样,将收集到的同一种组分合并,在_40°C预冻后进行冷冻干燥,冷冻干燥真空度为30Pa,冷冻干燥温度-50°C,干燥时间48h,得到马铃薯蛋白抗氧化肽/
权利要求
一种高效抗氧化剂——马铃薯蛋白抗氧化肽的制备方法,其特征在于以工业马铃薯蛋白为原料,用水配制悬浊液,调pH后加入碱性蛋白酶Alcalase进行酶解,灭酶冷却,离心微滤,滤液经真空浓缩后用凝胶色谱柱分离,洗脱的组分经冷冻干燥得到三种马铃薯蛋白抗氧化肽,肽结构分别为Tyr-Phe-Glu、Asn-Tyr-Lys-Gln-Me及Thr-Tyr,分子量分布范围100~1034Da;制备步骤为(1)工业马铃薯蛋白原料其蛋白含量大于或等于80%;(2)配制悬浊液马铃薯蛋白粉加水搅拌,制成40g/L蛋白悬浊液;(3)~,温度48~52℃,调pH后加入碱性蛋白酶Alcalase进行酶解,酶活为400000u/mL,酶/底物蛋白粉干基计以mL/~,600-800r/min搅拌酶解1h,~;(4)灭酶冷却将所得酶解液升温加热至80℃,保温15min灭酶,快速冷却;(5)离心微滤酶解液经5000r/min离心25min,;(6),温度45~50℃下真空浓缩至固形物含量50%以上;(7)凝胶色谱柱分离以SephadexG15
为填料填充层析柱,以蒸馏水为洗脱剂平衡填充好的层析柱12~16h后备用;将检测器波长设定在280nm,取8~10mL步骤(6)所得的浓缩液加入填充SephadexG15填料的凝胶层析柱进行分离,以蒸馏水为洗脱剂,~,打开记录仪在记录仪上记录凝胶层析柱组分洗脱的信号,随着洗脱的进行记录仪记录下不同的洗脱峰,等到记录仪上记录的信号值和初始时的信号值接近时,平衡一个柱体积后结束分离过程,按照记录仪上记录下的不同洗脱峰分别收集相应的样品,得到不同分子量分布的组分,多次重复上样,将收集到的同一种组分合并;共收集得到三个组分,结构分别为Tyr-Phe-Glu、Asn-Tyr-Lys-Gln-Me及Thr-Tyr,分子量分布范围为100~1034Da;(8)冷冻干燥将得到的收集组分冷冻干燥,冷冻干燥真空度为10~30Pa,温度-30~-55℃,干燥时间48h,水分含量低于5%,干燥后得到的产品即为马铃薯蛋白抗氧化肽。
全文摘要
一种高效抗氧化剂——马铃薯蛋白抗氧化肽的制备方法,属于农产品精深加工技术领域。本发明以工业马铃薯蛋白为原料,通过碱性蛋白酶Alcalase水解、酶解液微滤浓缩、SephadexG15凝胶色谱柱分离、冷冻干燥等步骤,获得新型、高效的马铃薯蛋白抗氧化肽产品,肽结构分别为YFE(Tyr-Phe-Glu)、NYKQM(Asn-Tyr-Lys-Gln-Me)和TY(Thr-Tyr),抗氧化肽的相对分子量范围为
100-1043Da。本发明所制备的产品具有较强的清除自由基能力,可以有效增加乳状液中脂肪的氧化稳定性,产品安全性高,且制备方法简单,可有效改善马铃薯蛋白的功能性质,对马铃薯蛋白的深加工和附加值的提高以及马铃薯的综合利用和产业链的延长都有重要的意义。