文档介绍：实时定量PCR技术及其应用
2004年5月28日
姓名:肖云刚学号:**********
(宁夏大学生命科学学院,2002级生物技术(1)班)
摘要:实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测,快速,灵敏,精确等特点,是对原有PCR技术的革新,-PCR技术的原理及其应用。
关键词:实时定量,PCR,基因,荧光探针,应用
聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction)(PCR)首见报道于1985年,是一种体外扩增DNA片段的技术,已经广泛应用于人类遗传病的基因诊断,产前诊断,临床医学如传染病致病原细菌即病毒的检测,肿瘤,白血病的诊断,癌基因探索等,在分子生物学中应用于基因组DNA或mRNA序列的直接测定,基因分离,克隆,定点致突变,基因突变的直接检测以及法医学等。之所以如此,是由于通过PCR可使极少量复杂的基因组DNA或总RNA样品中特定基因片段,在短短几小时内扩增上百万倍拷贝。
PCR技术自问世以来得到了不断发展,20世纪90 年代发展起来的由美国Applied biosysems公司推出的实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基因利用荧光信号积累实时检测整个
PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它除了具有PCR的高灵敏性外,还具有可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果,精确性高;定量和扩增同步进行,克服了PCR的平台效应;特异性和可靠性更强;能实现多重反应;无污染性;具实时性和可靠性等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究领域和医学研究等领域。
1:实时定量PCR技术的概述
1. 1两个重要概念的说明
(1)荧光阈值(threshold):以PCR反应的前15个循环的荧光信号,一般荧光阈值定义为3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
(2)Ct值:也称循环阈值,C代表Cycle,t代表threshold。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值是所经历的循环数(如图1所示)。经数学证明,Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值(如图2所示)。这样,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
作用原理 RQ-PCR技术是指在PC反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。实时定量PCR常用的检测模式有TaqMan探针和SYRB Green 1
检测模式。
(1) TaqMan探针方法的作用原理
这种方法的原理主要是利用DNA的5’-3’核酸外